Proteomic Identification of α-Amylase Isoforms Encoded by RAmy3B/3C from Germinating Rice Seeds

α-Amylase（EC 3.2.1.1）は、胚乳（starchy endosperm）に蓄えられたデンプンを加水分解し、発芽初期の幼植物の成長を支えるため、イネ種子の発芽において中心的な役割を担う。イネ種子には複数のα-amylaseアイソフォームが含まれており、等電点電気泳動（isoelectric focusing：IEF）によって分離できる。これまでの研究では、これらのアイソフォームが物理化学的性質および血清学的性質に基づいてクラスやサブグループに分類されてきた。イネには少なくとも10種の異なるα-amylase遺伝子が存在すると報告されているが、個々の遺伝子と、対応する天然（native）のアイソフォームタンパク質との正確な対応づけは、十分には解決されていない。先行研究では、いくつかのアイソフォームが特定の遺伝子（例：RAmy1A、RAmy3D、RAmy3E）に割り当てられており、またクラスIIアイソフォームではGA3応答性の発現が示されていた。こうした背景のもと、本研究は、発芽中のイネ種子からα-amylaseアイソフォームを単離し、プロテオミクス手法（ペプチドマスフィンガープリンティング：MALDI TOF-MS）により、どの遺伝子がそれらをコードするかを同定することを目的とした。さらに、標的を絞ったMS/MSで確認を補完した。

発芽中のイネ種子（最大5日）から、著者らはpI 4.60–6.20、分子サイズ41–44 kDaにわたる10個のα-amylaseタンパク質スポットを精製・分離した。これらは（高いpIから順に）A、B、E1、E2、K1、K2、K3、K4、K5、Lと命名された。Immunoblottingの結果、α-amylase I-1に対する抗体はアイソフォームAおよびBを認識した一方、K系列およびL系列のスポットとE1/E2は、α-amylase I-1またはII-4に対する抗体ではほとんど認識されなかった。これは、これらのタンパク質が、以前にRAmy1A（I-1）およびRAmy3D（II-4）の産物として割り当てられていたものとは抗原性が異なることを示している。Mascot検索を用いたMALDI TOF-MSのペプチドマスフィンガープリンティングにより、アイソフォームAおよびBはRAmy1A（スコア145–168、カバレッジ32–35%）に、複数のKアイソフォームはRAmy3B（スコア118–170、カバレッジ28–45%）に、LはRAmy3C（スコア135、カバレッジ32%）に、E1/E2はRAmy3E（スコア89–93、カバレッジ22–27%）に対応づけられた。さらに、ESI Q-TOF MS/MSにより代表的な割り当てが確認され、K2がRAmy3B由来であること、A/BがRAmy1A由来であることなどが裏づけられた。機能面では、アイソフォームAおよびBはE1/E2（26℃）およびKとL（37℃）よりも高い至適温度（70℃）を示した。RAmy3B由来のアイソフォーム群（新規アイソフォームII-5として分類）は、pIとサイズに顕著な多型性を示し、翻訳後の不均一性が大きいことが示唆された。

イネ種子（Oryza sativa L.）を表面殺菌（1% sodium hypochlorite、20 min）後、洗浄し、吸水させ、暗所30°Cで最大5日間発芽させた。タンパク質は1.2 mM CaCl2および1.6 mM NaClを含む20 mM acetate buffer（pH 5.3）で抽出し、ろ過と遠心（20,000 × g、20 min）で清澄化した。70%（NH4）2SO4で濃縮後、透析し、β-cyclodextrin Sepharose 6Bアフィニティクロマトグラフィーで精製した。結合した活性は8 mg/ml β-cyclodextrinで溶出した。アイソフォームは2D-PAGEで分離した。すなわち、native IEF-PAGE（pH 4–7）の後にSDS-PAGEを行い、CBB R-250染色で可視化した。エピトープ特性化のため、切り出したスポットを、既報のポリクローナル抗体（Poly anti-AB、Poly anti-H）およびモノクローナル抗体（Mono H-B35）を用いたwestern blottingで解析し、[35S]標識二次抗体とラジオアイソトープイメージングで検出した。酵素の至適温度は、native IEFゲルから活性アイソフォームを切り出して抽出し、温度範囲にわたり活性を測定することで求めた。同定のため、ゲルスポットをゲル内で還元／アルキル化し、トリプシン消化、ペプチド抽出、脱塩（ZipTipC18）後にMALDI-TOF-MSを実施し、ペプチドマスフィンガープリントはMascot検索で割り当てた。選択したペプチドについては、ESI Q-TOF MS/MSで追加の検証を行った。

本研究は、発芽中のイネ種子においてRAmy3BおよびRAmy3Cの遺伝子産物が天然のα-amylaseアイソフォームとして合成されることを、プロテオミクスにより直接的に示した。これにより、従来確立されていた対応づけ（例：RAmy1AおよびRAmy3E）を超えて、遺伝子からアイソフォームへの割り当てが拡張された。重要な結論として、MALDI-TOF-MSによるペプチドマスフィンガープリンティングは、非常に類似したイネα-amylaseファミリーのメンバー間（RAmy1A、RAmy3B/3C、RAmy3E間の類似性は83.7–90.4%と報告）を、天然種子アイソフォームのコード遺伝子を同定できる程度に十分識別できることが示された。著者らはまた、RAmy3A/3B/3Cからなるマルチジーンクラスターの中で、タンパク質レベルではRAmy3Bが優勢に発現していると主張しており、これはRAmy3B由来アイソフォームが検出可能であること、およびRAmy3A産物が十分に発現しているなら観察されるはずだという見込みと整合する。さらに、本研究はRAmy3BがコードするアイソフォームII-5の広範な多型性（複数のpIと小さなサイズ差のバリアント）を強調し、翻訳後の多様化がイネにおけるアイソフォームの全体像に大きく寄与することを改めて示した。総じて、本結果は発芽時におけるイネα-amylase遺伝子と天然タンパク質アイソフォームの対応関係をより厳密にし、未解決の曖昧さを解くうえでプロテオミクスに基づくマッピングが効率的な戦略であることを支持する。

著者らは、広範なアイソフォーム多型性の生化学的基盤、特にRAmy3BがコードするアイソフォームII-5で観察された広いpI分布の原因が未解明であると述べている。イネα-amylaseではN-glycosylationが知られているものの、論文ではそれがpIのシフトを説明しないとされ、解析からも、単純なC末端処理や単一の荷電残基の除去だけでは観察されたpI範囲を説明するには不十分であることが示唆されている。別の機構（例：イオン結合やsalt-bridge形成）が候補として提案されており、MS/MSに基づくさらなる検討が必要とされる。より広い観点では、本研究は包括的な遺伝子—タンパク質アイソフォーム対応表（gene–protein isoform map）を確立する継続的取り組みの一部として位置づけられている。著者らは、5つの遺伝子（RAmy1A、RAmy3B、RAmy3C、RAmy3D、RAmy3E）にコードされる20種以上の天然α-amylaseアイソフォームを同定したと述べ、組織特異的およびオルガネラ局在のα-amylaseアイソフォームの検討を継続する計画を示している。こうした継続研究は、イネの組織、発達段階、細胞内区画をまたいで遺伝子からアイソフォームへの関係を完全に解明するために必要である、という位置づけである。

αアミラーゼ(デンプンを分解して小さな糖にする酵素です。発芽した種が成長するためのエネルギーを取り出すのに重要です。)という酵素は、イネの種が発芽するときに、胚乳(種の中でデンプンなどの栄養がたまっている部分です。発芽直後の芽の栄養源になります。)にたまっているデンプンを分解して、芽が育つためのエネルギー源をつくる大事な働きをします。イネの種の中には、同じαアミラーゼでも少しずつ性質が違う「アイソフォーム(同じ種類のタンパク質でも、少しずつ形や性質が違う複数の型のことです。遺伝子の違いや、作られた後の変化で生じます。)」がいくつもあります。これらは、電気泳動という方法で分けて調べられます。
ただし、イネにはαアミラーゼの遺伝子が少なくとも10種類あるのに、どの遺伝子がどのアイソフォームを作っているのかは、まだはっきり整理できていませんでした。
そこでこの研究では、発芽中のイネ種子からαアミラーゼのアイソフォームを取り出し、プロテオミクス(細胞や組織にある多数のタンパク質をまとめて調べ、種類や量、由来を明らかにする研究手法です。)の方法を使って、それぞれがどの遺伝子（RAmy1AやRAmy3Bなど）に対応するのかを特定することを目的としました。

発芽中のイネ種子から、性質の違う10個のαアミラーゼ(デンプンを分解して小さな糖にする酵素です。発芽した種が成長するためのエネルギーを取り出すのに重要です。)のスポットが分けられ、A、B、E1、E2、K1〜K5、Lと名づけられました。
抗体(特定のタンパク質などに強く結びつく分子です。どのタンパク質があるかを調べる目印として使われます。)で調べると、AとBは既知のI 1型のαアミラーゼとして反応しましたが、K系列やL、E1/E2はこれまでの代表的な型（I 1やII 4）とは反応しにくく、別のタイプである可能性が示されました。
次に、質量分析でタンパク質の断片情報を調べたところ、AとBはRAmy1A、K系列は主にRAmy3B、LはRAmy3C、E1/E2はRAmy3Eの産物だと対応づけられました。さらに別の質量分析法でも、この対応が確かめられました。
働きの面では、AとBは活性が高くなる温度が70℃と高めだった一方で、E1/E2は26℃、KとLは37℃でよく働くなど、アイソフォーム(同じ種類のタンパク質でも、少しずつ形や性質が違う複数の型のことです。遺伝子の違いや、作られた後の変化で生じます。)によって性質が違いました。またRAmy3B由来のK系列は、電気的な性質や分子の大きさに細かい違いが多く、タンパク質が作られた後の変化が大きい可能性が示されました。

イネ種子を消毒して吸水させ、暗い場所で30℃、最大5日間発芽させました。発芽した種子からタンパク質を取り出し、塩析や透析で濃縮と精製を行ったあと、特定の物質に結合しやすい性質を利用したクロマトグラフィーでαアミラーゼ(デンプンを分解して小さな糖にする酵素です。発芽した種が成長するためのエネルギーを取り出すのに重要です。)をさらに精製しました。
その後、2段階の電気泳動でアイソフォーム(同じ種類のタンパク質でも、少しずつ形や性質が違う複数の型のことです。遺伝子の違いや、作られた後の変化で生じます。)を分離し、染色でスポットとして見えるようにしました。スポットは抗体(特定のタンパク質などに強く結びつく分子です。どのタンパク質があるかを調べる目印として使われます。)を使って性質を調べ、さらに質量分析でタンパク質断片を測定して、どの遺伝子産物かを推定し、一部は別形式の質量分析で追加確認しました。加えて、各アイソフォームがどの温度で最もよく働くかも測定しました。

この研究は、発芽中のイネ種子でRAmy3BとRAmy3Cが実際にタンパク質として作られ、天然のαアミラーゼ(デンプンを分解して小さな糖にする酵素です。発芽した種が成長するためのエネルギーを取り出すのに重要です。)アイソフォーム(同じ種類のタンパク質でも、少しずつ形や性質が違う複数の型のことです。遺伝子の違いや、作られた後の変化で生じます。)になっていることを、プロテオミクス(細胞や組織にある多数のタンパク質をまとめて調べ、種類や量、由来を明らかにする研究手法です。)によって直接示しました。これにより、これまでよく知られていたRAmy1AやRAmy3Eだけでなく、遺伝子とアイソフォームの対応関係がより広く、より正確になりました。
また、互いにとても似ているαアミラーゼ同士でも、MALDI TOF MS(レーザーで試料をイオン化し、飛行時間から質量を測る質量分析法です。多くのタンパク質を比較的速く調べられます。)を使った方法によって区別して遺伝子を特定できることが示されました。さらに、RAmy3B由来のアイソフォームが特に多く検出され、同じ近い領域にある別遺伝子よりも、タンパク質レベルではRAmy3Bが強く発現している可能性が示されました。
加えて、RAmy3B由来のアイソフォームには多様な型があり、タンパク質が作られた後の変化が、アイソフォームの種類の多さに大きく関わっていることが改めて示されました。

RAmy3B由来のアイソフォーム(同じ種類のタンパク質でも、少しずつ形や性質が違う複数の型のことです。遺伝子の違いや、作られた後の変化で生じます。)で、電気的な性質が広い範囲に分かれる理由はまだわかっていません。糖鎖がつく変化は知られていますが、それだけでは説明できないとされています。C末端の切れ方や、電荷をもつアミノ酸が1つ変わる程度でも説明が足りないため、別の仕組みとしてイオンの結合や分子内の結びつきの変化などが候補に挙げられています。今後はMS MS(特定の断片をさらに細かく壊して詳しい情報を得る質量分析の方法です。推定した結果の確認に使われます。)などで、より詳しく確かめる必要があります。
また研究全体としては、遺伝子とアイソフォームの対応表を完成させる取り組みの一部であり、今後は組織ごとの違いや、細胞内のどこに存在するかといった点も含めて調べ、イネの中での対応関係をより完全に明らかにしていく計画です。