Replicated association of the single nucleotide polymorphism in EDG1 with marbling in three general populations of Japanese Black beef cattle

筋肉内脂肪の蓄積は、牛脂肪交雑（beef marbling score: BMS）として評価され、脂肪交雑が高いほど食味が向上し、牛肉の品質評価に強く影響するため、牛肉生産における主要な経済形質である。これは、日本ではBMSが黒毛和種（Japanese Black beef cattle）の主要な育種目標として扱われていることから、特に重要である。著者らは以前、内皮分化スフィンゴ脂質Gタンパク質共役受容体1（endothelial differentiation, sphingolipid G-protein-coupled receptor, 1: EDG1）遺伝子における一塩基多型（single nucleotide polymorphism: SNP）であるc.-312A>Gが、大分県の黒毛和種集団においてBMSと関連し、Gアリルがより高いBMSと結び付くことを報告した。本研究は、他県の独立した一般集団においてこの関連の再現性を検証し、さらにこのSNPの遺伝子型が追加の枝肉形質（皮下脂肪厚（subcutaneous fat thickness: SFT）、枝肉重量（carcass weight: CWT）、ロース芯面積（rib eye area: REA）、バラ厚（rib thickness: RT））とも関連するかを評価することを目的とした。これらの再現検証と形質範囲の拡大により、c.-312A>Gがマーカー支援選抜（marker-assisted selection）プログラムに適用可能かを評価する意図があった。

3つの独立集団（鹿児島、宮崎、長崎）を通して、EDG1 c.-312A>Gと脂肪交雑（marbling）との関連は、2集団で支持され、残る1集団では示唆的であった。宮崎および長崎集団では、BMSに関して遺伝子型間の統計学的に有意な差が検出され、GGホモ接合体はAAホモ接合体よりBMSが高く、ヘテロ接合体は中間であり、以前に大分で報告された加算的（additive-like）パターンと一致した。鹿児島では、BMSに対する遺伝子型効果はわずかで統計学的有意には達せず（P > 0.05）、ただしGG個体が最も高いBMSを示す傾向があった。他の枝肉形質については、このSNPはSFTに有意な影響を示さず、これは大分での先行研究と一致した。集団ごとの形質シグナルも複数検出され、長崎ではCWT、鹿児島ではREA、長崎ではRTで有意な効果が観察され、いずれもGG > AG > AAであった。有意であった場合、BMS以外の枝肉形質に対するGアリルの効果の方向は、有害というより有利に見えた。各集団の遺伝子型頻度はHardy–Weinberg平衡に適合し、Gアリル頻度は長崎では、以前に大分および同程度の県で報告された値より低かった。

本研究では、鹿児島（去勢牛489頭）、宮崎（去勢牛160頭）、長崎（去勢牛191頭）の3つの独立した黒毛和種集団を調べた。各集団は父方半きょうだい（paternal half-sib）の去勢牛後代からなり、種雄牛数はそれぞれ72、45、40頭で、種雄牛1頭あたりの去勢牛頭数はそれぞれ1–110、1–18、1–36頭であった。脂肪組織サンプルを採取し、DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN）を用いてDNAを抽出した。EDG1におけるc.-312A>G SNPは、PCR–restriction fragment length polymorphism法によりジェノタイピングした。378-bpの増幅産物（amplicon）をMscIで消化し、アリル特異的なバンドパターン（AA: 163および215 bp、GG: 未消化の378 bp、AG: 3本）を得た。枝肉形質（BMS、SFT、CWT、REA、RT）は、日本の食肉格付制度に基づき認定格付員が測定した。著者らは生の表現型値ではなく、各形質の推定育種価（predicted breeding values）を表現型入力として用いた。育種価は、各県内で、地域の肥育去勢牛および未経産雌牛の枝肉記録を用いて別々に推定した。分散成分はMTDFREMLを用いたREMLにより推定し、育種価は単形質アニマルモデルの下でBLUPにより予測した。モデルには固定効果（性、市場年、農場）と二次の共変量（肥育期間、屠殺日齢）を含め、相加的遺伝効果はランダム効果として扱った。関連解析では、SNP遺伝子型を固定効果、種雄牛をランダム効果として含むモデルにより、遺伝子型差を評価した。

著者らは、EDG1 c.-312A>G SNPが一般的な黒毛和種集団においてBMSとの関連が再現されたと結論づけており、特に宮崎および長崎のデータセットで明確で、効果の方向は大分での先行所見と一致していた。鹿児島集団ではBMSに関して統計学的に有意な関連は示されなかったものの、観察された傾向は同じ遺伝子型の序列に沿っており、著者らは全体として集団をまたいだ再現性を支持するパターンであると解釈した。重要な点として、このSNPはSFTを増加させず、また他の枝肉形質（CWT、REA、RT）で関連が検出された場合には、Gアリルの効果は有利な方向（GGが最高、AAが最低、ヘテロ接合体が中間）であった。以上に基づき、先行報告と合わせて著者らは、EDG1におけるc.-312A>Gは、黒毛和種の脂肪交雑を高めることを目的とするマーカー支援選抜の実装に有用なマーカーであり、本研究で検討した枝肉形質において不利益な相関反応を示す明確な証拠はないと主張している。

本論文は、鹿児島県集団ではBMSに対する遺伝子型効果が統計学的に有意でなく、関連を検出する検出力（power）が不十分だった可能性があるとして、特に鹿児島集団での追加研究の必要性を指摘している。著者らはこれを県間の育種目標の違いに帰しており、鹿児島ではBMSよりもCWTが重視されているとされ、BMSに関わる量的形質遺伝子座（quantitative trait loci）がなお複数分離している可能性があり、それが利用可能なサンプルで検出されるSNP効果を希釈しうると示唆している。そのため、関連をより確定的に評価するには鹿児島でより大きなサンプルサイズが必要だとしている。より広い観点では、本研究はEDG1 c.-312A>G SNPを実用的なマーカー支援選抜の候補として位置づけており、今後の研究および育種プログラムでの検証は、多様な集団にわたる頑健性の確認と、他の枝肉形質を監視しつつBMSを高める選抜体系に組み込んだ場合の有用性評価に焦点を当てるべきだとしている。

牛肉の「脂肪交雑(筋肉内脂肪が網目状に入る状態のことです。見た目の「さし」を表し、食味や市場での評価に大きく影響します。)（さし）」は、筋肉の中に脂肪がどれくらい入っているかを表し、数値（BMS(Beef Marbling Scoreの略で、脂肪交雑の程度を点数で表す指標です。点数が高いほど「さし」が多く、価値が高く評価されやすいです。)）で評価されます。脂肪交雑が高いほど、やわらかさやおいしさが良くなり、牛肉の値段や評価に大きく関わります。日本では特に黒毛和種(日本で主要な肉用牛の品種で、脂肪交雑が入りやすい特徴があります。そのためBMSを上げる育種が特に重視されます。)で脂肪交雑が重視され、育種（よりよい牛を増やすこと）の大きな目標になっています。
研究者たちは以前、EDG1(脂質に関係する信号を受け取る受容体に関わる遺伝子の一つです。この研究では、EDG1のDNAの違いが脂肪交雑と関係するかを調べています。)という遺伝子の中の「c.-312A>G(EDG1遺伝子の特定の場所で、AかGかの違いがあるSNPを指します。この研究では、Gを持つほどBMSが高い傾向があるかを確認しました。)」というSNP(DNAの塩基が1文字だけ違うタイプの個体差です。体の特徴に関わることがあり、育種で目印（マーカー）として使える場合があります。)（DNAの違い）が、BMSと関係し、Gというタイプを持つ牛ほどBMSが高いことを大分県の集団で見つけました。
そこで本研究では、別の県（鹿児島・宮崎・長崎）の独立した集団でも同じ関係が成り立つかを確かめ、さらにBMS以外の枝肉形質(と畜後の枝肉で測る特徴のことです。肉の価値に関わるため、育種や品質評価で重要です。)（SFT(Subcutaneous Fat Thicknessの略で、皮下脂肪の厚さです。厚すぎると好まれない場合もあるため、BMSと一緒に確認されます。)、CWT(Carcass Weightの略で、枝肉の重さです。生産量や収益に関係します。)、REA(Rib Eye Areaの略で、ロース芯（胸最長筋）の断面積です。肉量の目安になり、枝肉の評価に使われます。)、RT(Rib Thicknessの略で、バラの厚さ（肋の部分の厚み）です。枝肉の体格や肉付きの指標になります。)）とも関係があるかを調べました。将来的に、このSNPが「マーカー支援選抜(遺伝子の目印（マーカー）を使って、望ましい形質を持ちやすい個体を選んで繁殖に利用する方法です。成長を待たずに遺伝的な見込みで選べる点が利点です。)」に使えるかを判断することも目的です。

3つの県の集団をまとめて見ると、EDG1(脂質に関係する信号を受け取る受容体に関わる遺伝子の一つです。この研究では、EDG1のDNAの違いが脂肪交雑と関係するかを調べています。) c.-312A>G(EDG1遺伝子の特定の場所で、AかGかの違いがあるSNPを指します。この研究では、Gを持つほどBMSが高い傾向があるかを確認しました。)と脂肪交雑(筋肉内脂肪が網目状に入る状態のことです。見た目の「さし」を表し、食味や市場での評価に大きく影響します。)の関係は、2つの集団で明確に確認され、残り1つでも同じ方向の傾向が見られました。
宮崎と長崎では、遺伝子型によってBMS(Beef Marbling Scoreの略で、脂肪交雑の程度を点数で表す指標です。点数が高いほど「さし」が多く、価値が高く評価されやすいです。)に統計的に意味のある差があり、GGが最も高く、AAが最も低く、AGはその中間でした。これは大分県で見つかった「Gが増えるほどBMSが上がる」形と一致しました。
鹿児島では統計的に有意とは言えませんでしたが、GGが高くなりやすい傾向はありました。
また、皮下脂肪厚（SFT(Subcutaneous Fat Thicknessの略で、皮下脂肪の厚さです。厚すぎると好まれない場合もあるため、BMSと一緒に確認されます。)）にはこのSNP(DNAの塩基が1文字だけ違うタイプの個体差です。体の特徴に関わることがあり、育種で目印（マーカー）として使える場合があります。)のはっきりした影響は見られませんでした。一方で、県によっては枝肉重量（CWT(Carcass Weightの略で、枝肉の重さです。生産量や収益に関係します。)）、ロース芯面積（REA(Rib Eye Areaの略で、ロース芯（胸最長筋）の断面積です。肉量の目安になり、枝肉の評価に使われます。)）、バラ厚（RT(Rib Thicknessの略で、バラの厚さ（肋の部分の厚み）です。枝肉の体格や肉付きの指標になります。)）で遺伝子型の差が見つかり、その場合もGGが高く、AAが低く、AGが中間でした。つまり、BMS以外でも影響があるときは、Gが不利というより有利に働く可能性が示されました。
さらに、各集団の遺伝子型の出方はハーディ ワインベルグ平衡(集団の中で遺伝子型の割合が、理論的に期待される割合と大きくずれていない状態です。データが偏っていないかの確認に使われます。)に合っており、Gの割合は長崎でやや低めでした。

鹿児島489頭、宮崎160頭、長崎191頭の黒毛和種(日本で主要な肉用牛の品種で、脂肪交雑が入りやすい特徴があります。そのためBMSを上げる育種が特に重視されます。)去勢牛を調べました。これらは同じ父牛を持つ半きょうだい関係の個体群を含みます。
脂肪組織からDNAを取り出し、PCRと制限酵素を使う方法でEDG1(脂質に関係する信号を受け取る受容体に関わる遺伝子の一つです。この研究では、EDG1のDNAの違いが脂肪交雑と関係するかを調べています。)のc.-312A>G(EDG1遺伝子の特定の場所で、AかGかの違いがあるSNPを指します。この研究では、Gを持つほどBMSが高い傾向があるかを確認しました。)を判定しました。
枝肉形質(と畜後の枝肉で測る特徴のことです。肉の価値に関わるため、育種や品質評価で重要です。)（BMS(Beef Marbling Scoreの略で、脂肪交雑の程度を点数で表す指標です。点数が高いほど「さし」が多く、価値が高く評価されやすいです。)、SFT(Subcutaneous Fat Thicknessの略で、皮下脂肪の厚さです。厚すぎると好まれない場合もあるため、BMSと一緒に確認されます。)、CWT(Carcass Weightの略で、枝肉の重さです。生産量や収益に関係します。)、REA(Rib Eye Areaの略で、ロース芯（胸最長筋）の断面積です。肉量の目安になり、枝肉の評価に使われます。)、RT(Rib Thicknessの略で、バラの厚さ（肋の部分の厚み）です。枝肉の体格や肉付きの指標になります。)）は日本の食肉格付のルールに基づき格付員が測定しました。解析では、生の測定値ではなく「推定育種価(その牛が子にどれだけ良い形質を伝えられそうかを、記録や血縁情報から統計的に推定した値です。環境の影響を減らして遺伝の力を見やすくします。)」を使い、統計モデルで遺伝子型による差を評価しました（遺伝子型は固定効果(性別や飼育農場など、あらかじめ影響があると考えてモデルに入れる要因です。遺伝子型の差を公平に比べるために使います。)、父牛はランダム効果(父牛など、集団の中で偶然のばらつきとして扱う要因です。血縁の影響を調整するのに役立ちます。)として扱うなど）。

EDG1(脂質に関係する信号を受け取る受容体に関わる遺伝子の一つです。この研究では、EDG1のDNAの違いが脂肪交雑と関係するかを調べています。)のc.-312A>G(EDG1遺伝子の特定の場所で、AかGかの違いがあるSNPを指します。この研究では、Gを持つほどBMSが高い傾向があるかを確認しました。)は、一般的な黒毛和種(日本で主要な肉用牛の品種で、脂肪交雑が入りやすい特徴があります。そのためBMSを上げる育種が特に重視されます。)集団でもBMS(Beef Marbling Scoreの略で、脂肪交雑の程度を点数で表す指標です。点数が高いほど「さし」が多く、価値が高く評価されやすいです。)との関係が再現され、とくに宮崎と長崎で明確でした。鹿児島では有意ではないものの、同じ方向の傾向が見られたため、県をまたいでも同様の関係がある可能性が高いと考えられます。
重要なのは、このSNP(DNAの塩基が1文字だけ違うタイプの個体差です。体の特徴に関わることがあり、育種で目印（マーカー）として使える場合があります。)が皮下脂肪厚（SFT(Subcutaneous Fat Thicknessの略で、皮下脂肪の厚さです。厚すぎると好まれない場合もあるため、BMSと一緒に確認されます。)）を増やすとは言えず、さらに他の枝肉形質(と畜後の枝肉で測る特徴のことです。肉の価値に関わるため、育種や品質評価で重要です。)で差が出た場合もGが有利な方向（GGが高い）に働いていた点です。以上から、c.-312A>Gは脂肪交雑(筋肉内脂肪が網目状に入る状態のことです。見た目の「さし」を表し、食味や市場での評価に大きく影響します。)を高めるためのマーカー支援選抜(遺伝子の目印（マーカー）を使って、望ましい形質を持ちやすい個体を選んで繁殖に利用する方法です。成長を待たずに遺伝的な見込みで選べる点が利点です。)に役立つ候補であり、今回見た範囲では明確な不利益は確認されませんでした。

鹿児島で統計的に有意な結果が出なかったのは、サンプル数や集団の事情により、差を見つける力が足りなかった可能性があります。研究者たちは、県によって育種で重視する形質が違い（鹿児島はBMS(Beef Marbling Scoreの略で、脂肪交雑の程度を点数で表す指標です。点数が高いほど「さし」が多く、価値が高く評価されやすいです。)より枝肉重量を重視する傾向）、BMSに関わる遺伝的な要因が集団内に多く残っていると、1つのSNP(DNAの塩基が1文字だけ違うタイプの個体差です。体の特徴に関わることがあり、育種で目印（マーカー）として使える場合があります。)の効果が見えにくくなる場合があると考えています。
そのため、鹿児島ではより大きなサンプルで追加研究が必要です。また今後は、より多様な集団で確かめながら、他の枝肉形質(と畜後の枝肉で測る特徴のことです。肉の価値に関わるため、育種や品質評価で重要です。)への影響も監視しつつ、実際の選抜に組み込んだときに本当に役立つかを評価していくことが求められます。