Association of a single nucleotide polymorphism in titin gene with marbling in Japanese Black beef cattle

牛肉のmarbling（霜降り）は枝肉価値を大きく左右するため、肉用牛の育種における重要な選抜形質である。本論文は、marker-assisted selection（マーカー支援選抜）をより効果的に進めるため、日本黒毛和種におけるmarblingの分子・遺伝学的基盤をより深く理解する必要性に取り組んでいる。著者らは先行研究を踏まえ、この品種ではEDG1の発現量およびEDG1 single nucleotide polymorphisms（SNPs）がすでにmarblingと関連づけられていることを述べる。続いて、新たな候補遺伝子としてtitin（TTN）を、以下の2つの先行根拠に基づいて位置づける。(i) musculus longissimus筋における過去のdifferential-display PCRデータでは、肥育後期においてlow-marbled去勢牛のほうがhigh-marbled去勢牛よりTTN発現が高く、TTN発現の低下が筋肉内脂肪の増加と関係する可能性が示唆されたこと、(ii) TTNがウシ染色体2上の領域に位置し、そこは日本黒毛和種でmarbling quantitative trait locus（QTL）が報告されている領域に含まれること、である。本研究の目的は、TTNの制御領域またはエクソン領域にあるpolymorphisms（多型）を同定し、検出されたSNPが日本黒毛和種のmarbling（加えて皮下脂肪厚）と関連するかを検証することにあった。

標的としたTTN領域のシーケンスにより、探索（discovery）に用いたlow-およびhigh-marbled個体を区別する単一の多型が同定された。すなわち、プロモーター領域にあるCからTへのtransitionであり、推定される転写開始点の上流652 bpに位置していた（g.231054C>T; dbSNP ss accession number 120037472）。関連解析では、このSNPは3つの実験を通じてmarblingとの関連を示す一方、皮下脂肪厚との関連を示す証拠は得られなかった。実験1（日本黒毛和種の種雄牛101頭）では、遺伝子型差はmarblingで有意（P = 0.004）であったが、皮下脂肪厚では有意ではなかった（P = 0.984）。CT種雄牛はCC種雄牛よりmarblingの育種価が高く、TT種雄牛（n = 4）はサンプル数が少ないため解析から除外された。実験2（heterozygous種雄牛5頭由来の父方半きょうだい子牛848頭）では、SNP遺伝子型はmarblingに影響した（P = 0.046）が、皮下脂肪厚には影響しなかった（P = 0.749）。TT子牛はCCよりmarblingが高く、ヘテロ接合体は中間であった。実験3（CC種雄牛3頭由来の父方半きょうだい子牛820頭）では、遺伝子型効果はmarblingで境界的な有意性に達し（P = 0.051）、皮下脂肪厚では有意ではなかった（P = 0.310）。CT子牛はCCよりmarblingが高い傾向を示した。著者らは、全体としてTアリルが日本黒毛和種におけるmarblingの高さと関連することを示すパターンであり、母牛（dams）を一般集団の代表として扱ったデザインにより再現性の信頼性が強まった、と解釈している。

本研究は、遺伝子構造の記述、標的シーケンスによるSNP探索、そして推定育種価を表現型とした3つの関連解析実験を組み合わせた。まず著者らは、公的なウシTTN cDNA配列（GenBank:XR_027685）をウシのゲノムcontig（GenBank:NW_001494580）にアラインし、遺伝子構造を記述した。その結果、TTNは276,648 bpにわたり、内部エクソン313個に加えて最初と最後のエクソンを含み（イントロンは314個）構成されると結論づけた。SNP探索では、5’フランキング領域6,615 bp、最初のエクソン領域211 bp、最後のエクソン領域1,315 bpを、marblingとTTN発現パターンについて以前に対比されていた4個体のDNAを用いてシーケンスした。内訳は、low-marbledのHolstein去勢牛2頭と、日本黒毛和種の伊藤福（Itofuku）種雄牛由来のsomatic nuclear-derived cloned steers（体細胞核移植由来クローン去勢牛）でhigh-marbledの2頭である。PCR産物は直接シーケンスし、クロマトグラム比較により変異を同定し、HGVS nomenclatureに従って表記した。関連解析では、g.231054C>TをPCR-RFLP（227-bp増幅産物をHpyCH4IIIで消化）でジェノタイピングし、(1) 日本黒毛和種種雄牛101頭、(2) heterozygous種雄牛5頭由来の父方半きょうだい子牛848頭、(3) CC種雄牛3頭由来の父方半きょうだい子牛820頭、で評価した。表現型は、marbling score（1–12、日本の食肉格付け制度）と皮下脂肪厚のpredicted breeding values（推定育種価）であり、これらは大分の記録システムにより、48,045頭（1988–2003）の枝肉データから導出された。育種価はREML/BLUP（MTDFREML）により、単形質のanimal modelの下で推定した。固定効果は性、market-year、farm、共変量は肥育期間およびと畜日齢（最大二次まで）で、相加的遺伝効果はランダム効果として扱った。関連モデルではSNP遺伝子型効果、および該当する場合はgenotype-by-sire interactionを検定し（実験2および3では非有意として報告され、モデルから除外）、解析した。

本論文は、TTNプロモーターSNPであるg.231054C>Tが日本黒毛和種のmarblingと関連し、Tアリルがmarbling増加と結びつく一方、3つの実験すべてで皮下脂肪厚との関連は検出されなかった、と結論づけている。著者らは、実験間での一貫性—とりわけ母牛を集団からのランダムサンプルとみなした実験—が、この関連が実在する可能性を支持すると述べる。同時に、推定育種価を用いると、同一種雄牛内では子の育種価に対する種雄牛の寄与が同一になることを意味するため、半きょうだいデザインでは母牛サンプリングに注意が必要である点も指摘している。重要な点として、このSNPはプロモーター領域に位置し、著者らはプロモーター活性を介してTTN発現とmarblingに影響しうると仮説するが、変異は既知の標準的な転写関連配列（canonical transcription-related sequence）には含まれないことを強調している。したがって、g.231054C>T自体が原因変異であるよりも、未知の原因変異とlinkage disequilibriumにある可能性が高いと考察している。実用的含意として、確認とより広い検証の必要性を認めつつ、このTTN SNPを、既報のEDG1 SNPsと併せて、日本黒毛和種のmarbling改良を目的としたmarker-assisted selectionの支援に用いうると提案している。

著者らは、得られた知見と限界から直接導かれる複数の課題を示している。まず、g.231054C>Tとmarblingのアリル関連を確認し、結果の一般化をより堅牢にするため、さらなる反復研究（replicate studies）が必要だとしている。次に、「アリルの可能な遺伝子型組合せをすべて評価するよう結果を拡張する」必要性を述べ、より広いサンプリングと遺伝子型の代表性が推論を強めること、特に一部遺伝子型の頻度が低い場合（例：実験1の種雄牛におけるTT）に重要であることを示唆している。機構面では、TTN発現に対するプロモーター効果が仮説として提示される一方、既知の転写モチーフとの重なりがないことから、g.231054C>Tと連鎖する真に機能的な変異（functional mutation(s)）のマッピングと同定を優先課題とすべきだとしている。最後に、育種プログラムにおける応用的追試として、追加検証と、観察された関連の遺伝的構造の解明を条件に、TTN SNP情報（EDG1マーカーと併せて）をmarker-assisted selectionスキームに組み込み、marblingを増加させることを提案している。

牛肉の霜降りは、枝肉の値段を大きく左右するため、肉用牛を改良するときの重要な目標の1つです。この研究では、日本黒毛和種で霜降りに関わる遺伝子を見つけ、DNA情報を使って効率よく選ぶ方法をより良くしたいと考えました。
これまでにEDG1(血管の形成などに関わるとされる遺伝子で、日本黒毛和種では霜降りとの関連が報告されています。霜降りに関わる候補遺伝子の1つとして研究に使われます。)という遺伝子のはたらきや、その遺伝子のSNPが霜降りと関係することが知られていました。そこで著者らは、新しい候補としてTTNという遺伝子に注目しました。理由は、(1) 過去の実験で、霜降りが少ない牛のほうが肥育後期にTTNの発現が高い傾向があり、TTNの発現が下がることが霜降りの増加と関係する可能性が示されたこと、(2) TTNがある染色体上の場所が、霜降りに関係する領域として報告されている場所と重なること、の2点です。
この研究の目的は、TTNの発現を調整する領域や遺伝子の本体部分にある多型(集団の中で一定割合見られるDNAの違いのことです。個体差の原因になりうるため、性質との関連を調べます。)を探し、見つかったSNPが霜降り（さらに皮下脂肪の厚さ）と関係するかを確かめることです。

TTNの狙った領域のDNA配列を調べたところ、霜降りが少ない個体と多い個体を区別できる多型(集団の中で一定割合見られるDNAの違いのことです。個体差の原因になりうるため、性質との関連を調べます。)が1つ見つかりました。これはプロモーター領域(遺伝子のスイッチに関わるDNA領域で、遺伝子がどれくらい働くかを調整します。ここに変化があると発現量が変わり、性質に影響することがあります。)にあるCからTへの変化で、転写開始点(DNAからRNAを作り始める位置のことです。この周辺は遺伝子の発現調節にとって重要です。)と考えられる場所より上流652bpの位置にありました（g.231054C>T）。
その後の解析では、このSNPは3つの実験を通して霜降りとの関係が見られましたが、皮下脂肪の厚さとの関係ははっきりしませんでした。
実験1（種雄牛101頭）では、遺伝子型の違いは霜降りで有意でしたが、皮下脂肪厚では有意ではありませんでした。CTの種雄牛はCCより霜降りの育種価が高く、TTは頭数が少なすぎたため分析から外されました。
実験2（特定の種雄牛5頭の子ども848頭）でも、SNPの遺伝子型は霜降りに影響しましたが、皮下脂肪厚には影響しませんでした。TTが最も霜降りが高く、CTはその中間でした。
実験3（CCの種雄牛3頭の子ども820頭）では、霜降りとの関係はぎりぎり有意に近い結果で、皮下脂肪厚は有意ではありませんでした。CTはCCより霜降りが高い傾向でした。
全体として、Tアリル(同じ遺伝子の同じ場所にある、別バージョンのDNA配列のことです。例えばこの研究ではCアリルとTアリルがあり、どちらを持つかで霜降りに差が出る可能性が調べられました。)を持つほど霜降りが高くなりやすい、という流れが示されました。

研究は大きく、(1) TTN遺伝子の構造の確認、(2) DNA配列を読んでSNPを探すこと、(3) 3つの集団で「SNPと性質の関係」を統計的に確かめること、を組み合わせて進めました。
まず、公的データベースのTTNのcDNA配列を牛のゲノム配列に対応づけて、TTN遺伝子がとても長く、多数のエクソン(遺伝子のうち、最終的にRNAに残ってタンパク質の情報になりやすい部分です。変化が起きるとタンパク質の性質が変わることがあります。)とイントロンからできていることを整理しました。
次に、プロモーター付近、最初のエクソン、最後のエクソンを対象に、霜降りが少ない牛2頭と霜降りが多い牛2頭のDNAを比較して配列を決め、変化を探しました。その結果、差はg.231054C>Tの1か所だけでした。
関連解析では、このSNPをPCR-RFLP(PCRで特定のDNAを増やし、制限酵素で切れるかどうかの違いを利用して遺伝子型を判定する方法です。比較的シンプルにSNPを調べられます。)という方法で遺伝子型判定し、霜降りスコアと皮下脂肪厚の推定育種価(その個体が子どもにどれくらい有利な遺伝的特徴を伝えそうかを、成績データと血縁情報から推定した値です。育種での選抜判断に使われます。)を使って統計解析しました。推定育種価は、過去に集めた大量の枝肉データをもとに、遺伝の影響などを考慮する計算手法で求めました。

TTN遺伝子のプロモーターにあるSNP（g.231054C>T）は、日本黒毛和種の霜降りと関係し、Tアリル(同じ遺伝子の同じ場所にある、別バージョンのDNA配列のことです。例えばこの研究ではCアリルとTアリルがあり、どちらを持つかで霜降りに差が出る可能性が調べられました。)が霜降りの増加と結びつく可能性が示されました。一方で、皮下脂肪厚とは3つの実験すべてで関係が見つかりませんでした。
ただし、このSNP自体が霜降りを直接増やす「原因」とは限りません。プロモーター領域(遺伝子のスイッチに関わるDNA領域で、遺伝子がどれくらい働くかを調整します。ここに変化があると発現量が変わり、性質に影響することがあります。)にあるため遺伝子の発現に影響する可能性はありますが、よく知られた典型的な転写の目印となる配列には当てはまらないため、実際には近くにある別の原因変異と一緒に受け継がれているだけの可能性も高い、と考察しています。
それでも、霜降り改良に役立つ手がかりになる可能性があるため、既に報告されているEDG1(血管の形成などに関わるとされる遺伝子で、日本黒毛和種では霜降りとの関連が報告されています。霜降りに関わる候補遺伝子の1つとして研究に使われます。)のSNPと合わせて、DNA情報を使った選抜に利用できるかもしれない、と提案しています。

まず、このSNPと霜降りの関係が本当に安定して成り立つかを確かめるため、別の集団でも繰り返し検証する必要があります。
また、今回のように一部の遺伝子型（例：TT）が少ないと結論が不安定になりやすいので、より多くの個体を集め、可能な遺伝子型の組み合わせを十分に評価することが重要です。
仕組みの面では、g.231054C>Tが直接はたらくのか、それとも別の原因変異と連鎖しているのかを調べるため、近くにある本当の機能的変異を探し出す研究が必要です。
これらが確認できれば、EDG1(血管の形成などに関わるとされる遺伝子で、日本黒毛和種では霜降りとの関連が報告されています。霜降りに関わる候補遺伝子の1つとして研究に使われます。)マーカーなどと一緒に育種プログラムへ組み込み、霜降りを増やすための選抜に活用することが期待されます。