Identification of myo-inositol hexakisphosphate (IP6) as a β-secretase 1 (BACE 1) inhibitory molecule in rice grain extract and digest

Alzheimer病（AD）は、脳内にamyloid-β peptide（Aβ）が蓄積することと強く関連しており、Aβプラークは臨床症状の約15年前に出現すると報告されている。Aβが後に（例：免疫療法により）減少しても、神経損傷や認知機能低下は可逆的ではないため、著者らはAβ蓄積の予防を優先課題として位置づけている。Aβは、amyloid-β precursor protein（APP）から、β-secretase 1（BACE1）とγ-secretaseによる連続的な切断で生成される。このためBACE1は、Aβ産生を抑えるうえで、とくに上流の魅力的な標的である。ADの発症率が生活習慣や食事（米を主食とする食事と小麦を主食とする食事の違いを含む）によって変化するという疫学的観察に基づき、本研究は「米粒にBACE1活性を阻害し、その結果Aβ産生を低下させる成分が含まれる」という仮説を検証した。目的は、(i) 米粒抽出物およびin vitroで調製した米の消化物によるBACE1阻害の評価、(ii) それらの調製物が培養細胞でAβ産生を抑制するかの検証、(iii) phytic acid（IP6）などのinositol phosphatesに着目し、阻害分子の同定である。

精白米・玄米のいずれの米粒抽出物も、in vitroで組換えヒトBACE1活性を著明に阻害した一方、パン用小麦粉抽出物では有意な阻害は見られなかった。玄米抽出物は精白米抽出物より強力で、1 μMのβ-secretase inhibitor III（BACE1の基質アナログ）に匹敵する阻害を示した。玄米をpepsinとpancreatinで模擬的に消化した後、<5 kDa画分（“5k-lower”）は、元の玄米抽出物と同程度のBACE1阻害活性を保持していた。これと同一手順で処理した酵素のみの対照はBACE1を阻害しなかったことから、活性が米由来であることが支持された。SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞では、米消化物（5k-lower）が対応するpepsin/pancreatin対照に比べて分泌Aβ1－xを有意に低下させ、細胞毒性の証拠は見られなかった。むしろ、生細胞シグナルは増加傾向、死細胞シグナルは減少傾向を示した。イオンクロマトグラフィーにより、玄米抽出物と消化物からIP6とIP4が検出され（IP3やIP5は検出されず）、パン用小麦粉抽出物ではIP6が検出されなかった。1 μg/mlでIP3～IP6を比較すると、強くBACE1活性を阻害したのはIP6のみであった。IP6（PS）は用量依存的阻害を示し、推定IC50は約0.18 μg/ml（0.25 μM）であった。細胞系では、IP6（SS）が10～1000 μg/mlで用量依存的にAβ分泌を低下させ、APPやBACE1の発現量を変えずにβ-CTFレベルを低下させた。著者らはまた、IP6が検討した部位においてneuregulin 1/heregulin-beta-2のBACE1切断を阻害しなかった（Supplementary Fig. 2）こと、さらに未公表のsurface plasmon resonance観察に基づき、BACE1切断部位を含むAPP由来ペプチドに結合しなかったことを報告した。これらの所見から著者らは、一般的な触媒活性の遮断ではなく、APP経路に選択的な調節を示唆するものとして解釈している。

米および小麦粉試料は水性抽出物として、精白米・玄米・パン用小麦粉をBACE1アッセイ用バッファー10倍量（w/v）に室温で1時間浸漬し、その後、不溶性成分を除くため遠心した。抽出物は内在性プロテアーゼを不活化するため加熱（95 °C、30分）し、再度清澄化したうえでBACE1試験に供した。消化管内消化を模倣するため、玄米粒をpepsin（0.26%、pH 2.0、2.5時間、37 °C）で処理した後、pancreatin（最終0.7%、pHを5.5に調整、2時間、37 °C）で処理し、加熱不活化（100 °C、20分）後に遠心し、5K MWCOスピンフィルターで分画した。流出画分（“5k-lower”）を酵素試験および細胞試験に用いた。In vitroのBACE1活性は、組換えヒトBACE1と蛍光基質ペプチド（EDANS/DABCYLペア）を用い、Triton X-100およびCHAPSを含む酢酸バッファー（pH 4.5）中で反応させ、インキュベーション後（37 °Cで5時間、または25 °Cで17時間）に励起355 nm／蛍光490 nmで測定した。統計学的有意差はStudent’s t-testで評価した。細胞への影響は、10% fetal bovine serumを含むDMEM/F-12で培養したSH-SY5Y細胞を用い、米消化物画分またはIP6（SS）をPBS中で24時間処理して検討した。培養上清中の分泌Aβ1－xは、82E1を捕捉抗体、ビオチン化4G8を検出抗体とするELISAで化学発光により測定し、multiplex cytotoxicity assayで得た生細胞マーカー（GF-AFC）で正規化した（同アッセイで死細胞マーカーbis-AAF-R110も測定）。抽出物／消化物中のinositol phosphate種（IP3～IP6）は、trichloroacetic acid処理と陽イオン交換クリーンアップ後にイオンクロマトグラフィーで分析し、Dionex ICS-2000、IonPac AS11カラム、電気伝導度検出を用いた。機序に関する細胞内指標として、24時間のIP6曝露後にWestern blotでβ-CTF（82E1）、全長APP（10D1）、BACE1、β-actinを測定した。

著者らは、米粒にはin vitroでBACE1を阻害し、培養ヒト神経芽細胞腫細胞でAβ産生を抑制しうる成分が含まれると結論づけ、玄米抽出物および消化物に存在する強力な阻害分子としてphytic acid（IP6；myo-inositol hexakisphosphate）を同定した。pepsin/pancreatin消化後も<5 kDa画分に活性が保持されたことは、阻害成分が模擬的な消化管条件下でも残存し得るという主張を支持する。細胞培養では、米消化物とIP6のいずれも、用いた評価法において明らかな細胞毒性を伴わずにAβ分泌を低下させ、IP6はAPPおよびBACE1の発現を変えずにβ-CTFを低下させたことから、β切断の段階またはそれより上流での阻害と整合的である。考察では、既存のsecretase標的戦略に対する利点の可能性が強調される。すなわち、γ-secretase阻害薬は経路特異性の限界に起因するとされる望ましくない副作用が示されており、少なくとも1つのBACE1阻害薬（LY2811376）は、ヒトでAβを低下させたにもかかわらず前臨床モデルで有害作用を生じたとされる。これに対し著者らは、米由来成分は食経験の観点からより安全である可能性があると述べ、IP6は（neuregulinの切断結果と未公表の結合データに基づき）BACE1触媒活性を広く遮断しない形で作用し得るため、APP以外のBACE1基質への干渉に伴うリスクを低減できる可能性があると示唆する。また、β-CTFが低下した一方でAPP量が増加しなかったことから、IP6がα-secretaseによる処理に影響する可能性を「perhaps」として付記している。

本論文は、米成分（IP6を含む）を、BACE1関連機序を介してAβ蓄積を抑えることでADを予防することを目指した、経口投与薬および／または食品開発のための「promising starting materials」と位置づけている。模擬消化後も阻害活性が残存したことは、経口利用の実現可能性を高める要素として提案されている。さらに、IP6が少なくとも1つの非APP性BACE1基質の切断（neuregulin 1/heregulin-beta-2のaa237–aa238）を阻害しないという見かけ上の特性は、APP以外のタンパク質に対するBACE1処理を阻害することで生じうる有害作用を回避するうえで望ましい特徴になり得るとして、今後の開発上の利点として示されている。一方で、IP6がどのようにしてAPP経路選択的にBACE1機能を調節するのか、またIP6がα-secretase活性にも影響するのか（これは確立した機序ではなく暫定的可能性として提示されている）など、未解決の機序的課題が残ることも述べられている。したがって本研究は、機序理解の精緻化と、より安全な予防的介入のリードとしての米由来分子の活用を、今後の研究課題として位置づけている。

アルツハイマー病は、脳の中にAβという物質がたまることと深く関係しています。AβのかたまりであるAβプラーク(Aβが集まってできるかたまりで、脳内に沈着します。症状が出るかなり前から現れるとされ、病気の早期変化の目印として重要です。)は、症状が出る約15年前から現れると報告されています。いったん病気が進んで神経が傷つくと、あとからAβを減らしても記憶力などの低下は元に戻りにくいので、研究者たちは「Aβがたまる前に防ぐこと」が大事だと考えました。
Aβは、APPというタンパク質がBACE1とγセクレターゼという酵素に順番に切られることで作られます。特にBACE1は最初の切断をするため、ここを止められればAβを作りにくくできると考えられます。
また、生活習慣や食事でアルツハイマー病になりやすさが変わるという観察があり、主食が米の地域と小麦の地域の違いにも注目しました。そこでこの研究は、「米粒の中にBACE1のはたらきを弱めてAβの産生を減らす成分がある」という仮説を確かめました。目的は、米の抽出物や消化をまねて作った液がBACE1をどれくらい阻害するか、細胞でAβを減らせるか、そして阻害の中心となる成分が何かを調べることです。

精白米と玄米の抽出物は、試験管内の実験でヒトのBACE1のはたらきを強く抑えました。一方、パン用小麦粉の抽出物では、はっきりした阻害は見られませんでした。玄米のほうが精白米より効果が強く、既知のBACE1阻害剤に近い程度の阻害を示しました。
さらに、玄米を胃や腸の消化をまねて酵素で分解したあと、分子が小さい部分だけを取り出しても、BACE1を抑える力が残っていました。酵素だけを同じように処理した対照では阻害が起きなかったため、この作用は米由来の成分による可能性が高いと考えられました。
人の神経系の培養細胞では、米の消化物によって分泌されるAβが有意に減り、細胞が傷つくような結果は見られませんでした。
成分分析では、玄米の抽出物と消化物からIP6とIP4が見つかりましたが、パン用小麦粉の抽出物からはIP6が検出されませんでした。IP3からIP6を比べると、BACE1を強く抑えたのはIP6だけでした。IP6は量が多いほどBACE1をより抑え、細胞でも量に応じてAβの分泌を減らしました。また、APPやBACE1の量自体は変えずに、途中産物であるβCTF(APPがBACE1によって切られた直後にできる途中の断片です。βCTFが減ることは、BACE1による切断が抑えられた可能性を示す手がかりになります。)を減らしました。
加えて、IP6は少なくとも一部の別のタンパク質に対するBACE1の切断を止めないことも示され、BACE1全体のはたらきを何でも止めるのではなく、APPの経路に偏って影響する可能性が示されました。

米（精白米・玄米）とパン用小麦粉を液体に浸して成分を取り出し、加熱などで不要な酵素の影響を減らしたうえで、BACE1の活性を測る実験に使いました。
また、体内の消化をまねるために玄米をペプシンとパンクレアチンで消化し、分子の大きさで分けて小さい成分を集めました。
BACE1の活性は、BACE1が特定の基質を切ると光り方が変わる仕組みを利用して測定しました。
細胞実験では、ヒト由来の神経芽細胞腫細胞(神経系のがんに由来する細胞で、培養しやすく実験に使われます。神経に関係する反応のモデルとして利用されます。)に米の消化物やIP6を加えて、培養液中に出てくるAβの量をELISA(特定のタンパク質などを抗体で検出して量を測る方法です。この研究では培養液中に分泌されたAβの量を測るために使われました。)で測りました。同時に、生きている細胞や死んだ細胞の指標も測り、毒性がないか確認しました。成分の同定にはイオンクロマトグラフィー(電荷の違いを利用して成分を分けて測定する分析法です。この研究ではIP6などの成分が含まれるかどうかの確認に使われました。)を用い、細胞内のタンパク質の変化はウエスタンブロットで調べました。

この研究は、米粒にはBACE1を抑え、細胞でAβの産生を減らしうる成分が含まれると結論づけました。そして、その強い候補としてIP6を特定しました。消化をまねた処理のあとでも効果が残ったことは、口から摂る形でも役立つ可能性を示します。
また、米の消化物やIP6は、少なくともこの実験条件では細胞に強い害を与えずにAβを減らしました。既存のγセクレターゼ阻害薬などでは副作用が問題になることがあり、BACE1阻害薬でも安全性の課題が報告されています。その点、米由来成分は食経験が長いことから、より安全な材料になりうるという考えが示されました。さらにIP6は、BACE1のはたらきを一律に止めるのではなく、APPの経路に選択的に影響する可能性があり、不要な副作用を減らせるかもしれないと述べています。

論文では、米の成分（IP6を含む）を使って、BACE1に関わる仕組みを通してAβの蓄積を抑え、アルツハイマー病を予防するための薬や食品の開発につなげられる可能性があるとしています。消化をまねたあとも効果が残った点は、経口で使える見込みを高める要素です。
一方で、IP6がなぜAPPの経路に偏ってBACE1のはたらきを調節できるのか、またαセクレターゼにも影響するのかなど、しくみの詳しい説明はまだ十分ではありません。今後は、作用のしくみをより正確に理解し、安全で効果的な予防方法につなげる研究が必要だとまとめています。