Nested PCRアッセイ法による日本人の口腔Helicobacter pyloriの検出率

Helicobacter pylori（H. pylori）は、慢性胃炎や消化性潰瘍に関与し、胃癌とも関連する主要なヒト病原体である。主な生息部位は胃であるが、唾液、歯肉縁上および歯肉縁下プラーク、う蝕象牙質、感染根管、舌苔などの口腔内ニッチでも、H. pylori DNAが繰り返し報告されてきた。しかし、口腔での報告有病率は0～100%と極端に幅があり、著者らはその要因として、研究対象集団やサンプリング戦略の不均一性、そしてとりわけ従来のPCRの限界（感度・特異度不足による偽陽性／偽陰性）を挙げている。解析性能を改善する方法としてnested PCRが提案されている。日本では胃のH. pylori感染が出生コホートを通じて著しく減少しているが、口腔内H. pylori有病率も同様に年齢（出生年）に伴って低下するのかは不明であり、もし低下が確認されれば口腔—胃の強い関連を支持することになる。そこで本研究は、日本人成人を対象にnested PCR法を用いて年齢（出生年）別の口腔内H. pylori DNAの有病率を推定し、性別、採取部位、既往歴（胃の除菌療法歴を含む）による相対頻度を検討することを目的とした。

nested PCRはsingle-step PCRよりもはるかに高頻度に口腔内H. pylori DNAを検出した。すなわち、nested PCRでは36.4%（32/88）が陽性であったのに対し、single-step PCRでは2.3%（2/88）であった。口腔内H. pyloriの有病率は性別で有意差がなく、年齢群（若年・中年・高齢）とも有意な関連を示さず、世代別有病率は21.4%～48.3%の範囲であった。一方、口腔内H. pylori DNAは、胃H. pyloriの除菌療法歴のある者で、除菌療法歴のない者よりも有意に多かった（p < 0.05; OR = 7.95）。解剖学的分布としては歯肉縁上のdental biofilmが主要なニッチであり、検出率は歯肉縁上biofilmが30.7%（27/88）で、唾液の4.5%（4/88）、舌の2.3%（2/88）を上回った。オッズ比は19.0（歯肉縁上biofilm）、2.0（唾液）、1（舌；基準）と報告された。歯肉縁上の部位別では、下顎前歯が最も陽性となる頻度が高く、次いで上顎前歯、下顎左側大臼歯、上顎右側大臼歯の順であった（p < 0.05）。口腔清掃指標（plaque control record、PI、および採取部位のPD）は、PCR陽性者と陰性者の間で有意差がなかった。陽性試料のnested PCR産物のシーケンスではH. pylori IID3023と100%相同性を示し、アッセイの特異性を支持した。

本研究では、2018年1月から2020年4月にかけて、新潟大学医歯学総合病院を歯科健診または歯科疾患で受診した成人88名（女性54名、男性34名；平均年齢52歳、範囲24～91歳）を募集した。適格基準は上下顎それぞれに少なくとも前歯と臼歯があることとし、過去3か月以内に全身性抗菌薬または抗菌性マウスウォッシュを使用していた者は除外した。既往歴は質問票で収集し、3名は定期的な内視鏡・組織学的検査で診断された胃H. pylori保菌者であり、12名は除菌療法歴を報告した。上部消化管症状を訴えた者はいなかった。口腔サンプリングは3つのニッチを対象とした。すなわち、非刺激唾液（2 mL）、4つの歯部位（上顎前歯、下顎前歯、上顎右側臼歯、下顎左側臼歯；欠損の場合は反対側部位で代替）からの歯肉縁上biofilm、ならびに標準化したストロークで舌ブラシを用いて採取した舌苔である。試料はPBS中で処理し、遠心、洗浄後、−80 ℃で保存し、市販キットでDNAを抽出した。H. pylori検出にはH. pyloriゲノムDNAを標的とするnested PCRプロトコルを用いた。第1ラウンドPCRはEHC-U/EHC-Lプライマーで行い、続いて内部プライマーET5U/ET-5Lで再増幅して228-bp断片を得た。陽性対照はH. pylori IID3023、陰性対照は水とした。アッセイ精度は、陽性試料43件の228-bp断片をシーケンスして評価した。解析感度は、H. pyloriとStreptococcus mutansの懸濁液を比率（1:1～1:10^-7）で混合してPCR前に調整することで定量した。統計解析は、有病率比較にカイ二乗検定／Fisherの正確確率検定（有意水準p < 0.05）を用い、粗オッズ比を算出し、プラーク指標については適切な検定を用いた。

著者らは、高感度のnested PCRアッセイを用いると、日本人成人の相当割合で口腔内H. pylori DNAが検出可能であり、その有病率は、日本における胃H. pylori感染でみられるような出生コホートに伴う低下を示さないと結論づけた。これに基づき、口腔内H. pyloriは胃の感染状態を単に反映するものというより、成人の口腔microfloraの通常成分である可能性があると論じている。同時に、胃の除菌療法歴を有する者で有病率が有意に高かったことは、胃感染の既往と口腔での検出との間に何らかの関連があることを示唆する。さらに本研究は、口腔内H. pyloriが相対的に極めて低い存在量である可能性も示した。nested PCRにより検出限界は10 CFU/mL（single-step PCRでは1 × 10^4 CFU/mL）まで改善され、著者らはH. pyloriが典型的な口腔内細菌量の<0.0001%を占める可能性が高いと推論した。歯肉縁上biofilm、とりわけ前歯部に優位に局在したことは、口腔内分布が一様ではなくサンプリングの妥当性に影響し得ることを示し、また除菌後の参加者1名で反復サンプリング時に検出が断続的であったことも指摘している。総合すると、本研究の意義は、検証済みの高感度アッセイを用いて日本人成人の年齢層別の口腔内有病率データを提示したこと、ならびに単純な口腔—胃の有病率の連動という見方に疑問を投げかけた点にある。

本論文は、さらなる研究を要する未解決の課題が複数あることを強調している。第一に、口腔が感染伝播源として機能するのか、あるいは除菌後の胃の再感染に寄与するリザーバーとなるのかは不明である。とくに本研究では、除菌療法を受けた者でも口腔内H. pylori DNAが検出された。第二に、共生的な口腔biofilm内における口腔内H. pyloriの生存性（viability）は確立されていない。著者らはDNA検出があるにもかかわらず培養が不成功であったと報告し、viabilityは不確実として扱っている。第三に、口腔内での最適な生息部位のより包括的なマッピングが必要であり、本研究でサンプリングした部位以外、具体的には歯肉縁下プラーク、う蝕、根管などの追加ニッチを調べる必要があると述べている。第四に、口腔内H. pyloriが口腔内微生態に影響し得ることから、その存在が口腔microbiota構成（dysbiosisを含む）、口腔疾患、胃癌再発とどのように関連するかを将来の研究で明らかにすべきだと提案している。最後に、口腔での検出が断続的になり得るという観察から、保菌者における口腔内H. pylori検出の精度向上のため、反復あるいは複数時点でのサンプリング戦略を推奨している。

ヘリコバクター ピロリ（H. pylori）は、胃にすみついて慢性胃炎(胃の粘膜に炎症が長く続く状態で、H. pylori感染が原因の一つになります)や胃・十二指腸の潰瘍に関わり、胃がんとも関係がある細菌です。主に胃にいる細菌ですが、唾液や歯の汚れ（プラーク）など、口の中からもH. pyloriのDNA(生物の設計図にあたる情報で、細菌がいた証拠として検出に使われます)が見つかったという報告があります。
ただし、口の中で見つかる割合は研究によって0～100%とバラつきが大きく、調べる人の集団や採取の方法の違い、そして従来のPCR(DNAを増やして検出しやすくする検査法で、少量のDNAの確認に使われます)検査では精度が十分でなく「本当はいるのに見逃す」「いないのにいると出る」ことがある点が原因だと考えられています。そこで、より正確に見つけやすいnested PCR(PCRを2段階で行って、より少ない量でも見つけやすくし、間違いも減らす方法です)という方法が注目されています。
また日本では、胃のH. pylori感染は若い世代ほど少なくなっています。しかし、口の中のH. pyloriも同じように若い世代ほど少ないのかはよく分かっていません。もし同じように減っているなら、口と胃の感染が強くつながっている可能性が高まります。
この研究では、日本人の成人を対象にnested PCRを使って、年齢（生まれた年代）ごとの口の中のH. pylori DNAが見つかる割合を調べ、性別、採取した場所、これまでの病歴（胃の除菌治療を受けたかなど）による違いも調べました。

nested PCR(PCRを2段階で行って、より少ない量でも見つけやすくし、間違いも減らす方法です)は、通常のPCR(DNAを増やして検出しやすくする検査法で、少量のDNAの確認に使われます)（single-step PCR）よりも、口の中のH. pylori DNA(生物の設計図にあたる情報で、細菌がいた証拠として検出に使われます)をはるかに多く見つけました。具体的には、nested PCRでは88人中32人（36.4%）が陽性だったのに対し、single-step PCRでは88人中2人（2.3%）だけでした。
口の中でH. pylori DNAが見つかる割合は、男女で差がなく、年齢（若年・中年・高齢）ともはっきりした関係がありませんでした。年代別でも約21.4%～48.3%の範囲で、若いほど少ないという傾向は確認されませんでした。
一方で、胃のH. pyloriを除菌する治療を受けたことがある人は、受けたことがない人よりも口の中でH. pylori DNAが見つかりやすいことが分かりました。
採取場所では、歯ぐきより上の歯の表面にある汚れ（歯肉縁上(歯ぐきの境目より上の歯の表面部分のことです)のdental biofilm(歯の表面にできる細菌の膜状の集まりで、プラークのことです)）で最も見つかりやすく、唾液や舌の汚れ（舌苔(舌の表面につく白っぽい汚れで、細菌などが集まったものです)）より検出率が高い結果でした。歯の中でも、特に下の前歯で陽性が多い傾向がありました。
また、歯みがきの状態を示す指標では、陽性の人と陰性の人の間で大きな差は見られませんでした。さらに、陽性となった検体のDNA配列を確認すると、H. pyloriのものと一致しており、検査が「別の菌を間違って検出した」可能性は低いと判断されました。

2018年1月～2020年4月に、新潟大学医歯学総合病院を受診した成人88人を対象にしました。直近3か月以内に抗菌薬や抗菌性のうがい薬を使った人は除外しました。病歴は質問票で集め、胃のH. pyloriに関しては、現在感染が確認されている人や、除菌治療を受けた人も含まれていました。
口の中のサンプルは、唾液、歯の汚れ（複数の歯の場所から採取）、舌苔(舌の表面につく白っぽい汚れで、細菌などが集まったものです)の3種類を採取しました。採取した試料からDNA(生物の設計図にあたる情報で、細菌がいた証拠として検出に使われます)を取り出し、H. pyloriのDNAを見つけるためにnested PCR(PCRを2段階で行って、より少ない量でも見つけやすくし、間違いも減らす方法です)を行いました。陽性になった試料の一部はDNA配列を調べて、本当にH. pylori由来かどうかを確認しました。
また、どのくらい少ない量まで見つけられるか（検出限界(検査で「存在する」と確認できる最も少ない量のことです)）も実験で確かめ、通常のPCR(DNAを増やして検出しやすくする検査法で、少量のDNAの確認に使われます)とnested PCRの感度(本当に存在するときに正しく「ある」と判定できる能力のことです)の差を比べました。統計的な差の確認には、主にカイ二乗検定(割合の差が偶然かどうかを統計的に確かめる方法です)やFisherの正確確率検定(人数が少ない場合にも使える、割合の差の検定方法です)などを使いました。

高感度(本当に存在するときに正しく「ある」と判定できる能力のことです)のnested PCR(PCRを2段階で行って、より少ない量でも見つけやすくし、間違いも減らす方法です)を使うと、日本人成人のかなりの割合で、口の中からH. pylori DNA(生物の設計図にあたる情報で、細菌がいた証拠として検出に使われます)が見つかることが示されました。しかし、その割合は、胃のH. pylori感染が若い世代ほど減っているのと同じようには減っておらず、年代による低下は確認できませんでした。
この結果から、口の中のH. pyloriは「胃に感染しているから口にもいる」という単純なものではなく、成人の口の中の細菌の集まりの一部として存在している可能性があると研究者は考えています。
ただし、胃の除菌治療を受けたことがある人で口の検出が多かった点は、胃の感染歴と口での検出に何らかの関係があることを示しています。
またnested PCRは、通常のPCR(DNAを増やして検出しやすくする検査法で、少量のDNAの確認に使われます)よりも非常に少ない量（10 CFU(生きた細菌の数を表す単位で、1個の細菌が増えてできる集落を1として数えます)/mL）まで見つけられることが分かり、口の中のH. pyloriは全体の細菌の中で極めて少ない割合しかいない可能性が高いと推測されました。さらに、歯の汚れの中でも前歯寄りで見つかりやすいなど、口の中で均一に分布していないことが示され、どこから採取するかが結果に大きく影響しうる点も重要です。

この研究は、まだ分かっていない問題が多いことも示しています。例えば、口の中がH. pyloriのうつり方（感染の広がり方）に関わるのか、あるいは胃の除菌後に再び感染する原因（隠れ場所）になるのかは不明です。
また、DNA(生物の設計図にあたる情報で、細菌がいた証拠として検出に使われます)が見つかっても、その菌が生きているかどうかは別問題で、培養(微生物を増やして生きているかを確認したり、詳しく調べたりする方法です)（生きた菌を増やすこと）がうまくいっていないため、口の中での生存性ははっきりしていません。
さらに、今回調べた場所以外（歯ぐきの下のプラーク、虫歯の部分、根管など）も含めて、どこに多いのかをもっと広く調べる必要があります。加えて、口の細菌バランスの乱れや口の病気、胃がんとの関係なども、今後の研究課題です。最後に、検出が毎回同じように出ない場合があるため、複数回採取するなど、より正確に調べる工夫が必要だと述べています。