口腔ケラチノサイトの増殖能を評価するための画像解析法を用いた細胞/コロニー運動の非侵襲的測定 : 再生医療用細胞品質管理ツールとして

上皮組織工学（例：表皮および角膜のcell sheet）の進歩により、製造中に治療上重要なkeratinocyteサブ集団が維持されていることを確認できる、堅牢な品質管理（quality control：QC）手法の必要性が高まっている。培養における細胞の「品質」を評価する従来法（定量的polymerase chain reactionやimmunohistochemistryなど）は、事後的かつ破壊的であり、移植を目的とする細胞をリアルタイムかつ無菌的にモニタリングする用途には適さない。そのため製造施設では、標準化が難しく定量性にも欠ける熟練者の目視検査に依存しているのが現状である。口腔keratinocyteはcell sheetを用いた治療や人工的に作製したmucosal constructで臨床使用されているが、規制要件に適合する形で、培養中の増殖能を非侵襲的かつ定量的に評価する確立した指標は存在しない。表皮keratinocyteにおいて、初期のコロニー運動が増殖能を予測しうるという先行知見に基づき、本研究は、time-lapse microscopyから口腔keratinocyteの細胞／コロニー運動をラベル不要（label-free）で定量化する実行可能な手法を開発・検証することを目的とした。具体的には、2つの相補的な画像解析アルゴリズムであるoptical flow（OF）とnormalised cross-correlation（NCC）を実装し、コロニー単位の2つの運動パラメータであるmean motion speed（MMS）とmean dynamic index（MDI）を算出し、これらの指標とコロニーの増殖能との関係を検討した。

ヒト初代口腔keratinocyteコロニーのtime-lapse位相差画像を用い、著者らは2つの定量的な運動指標の算出に成功した。すなわち、OFによりmotion speed（MS）を、NCCによりdynamic index（DI）を算出し、各コロニーについてフレーム全体で要約してMMSおよびMDIとした。代表的な3つのコロニーにおけるMMS（平均±標準偏差）はそれぞれ35.27 ± 10.54、30.42 ± 8.97、27.98 ± 11.64（μm/hour）であり、MDIはそれぞれ0.58 ± 0.11、0.54 ± 0.10、0.40 ± 0.13であった。MMSによるコロニーの順位づけはMDIによる順位づけと一致し、観察期間を通じてMSとDIの時間的パターンも類似しているように見えた。OF由来のMS推定は、3つのコロニーで個々の細胞を手動追跡した結果との比較により検証された（Supplemental material 4に記載）。また著者らは、NCC由来のDIが運動量と整合的に振る舞うと主張し、細胞／コロニーの移動が速いとDIが増加することから、DIが運動に関連した適切なパラメータであることを支持している。コロニーの増殖能をpopulation doublings（PD）で定量化したところ、MMSとMDIはいずれもPDと統計学的に有意な、弱〜中等度の正の線形相関を示した（Pearson相関が有意と報告されているが、本文抜粋にはrの正確な値は示されていない）。総じて、増殖能が高いコロニーほどMMSおよびMDIが高い傾向があり、この条件下ではコロニーの移動性が高いことが増殖能の高さと関連することが示唆された。

ヒト口腔粘膜サンプルは、機関承認（Niigata University Medical & Dental Sciences Hospital Internal Review Board, 2015–5018）およびインフォームド・コンセントの下で取得した。初代口腔keratinocyteを樹立し、継代培養を行った。組織は、1.5% Antibiotic-Antimycoticを含む0.025% trypsin/EDTAで室温約16 h処理し、keratinocyteを0.0125% defined trypsin inhibitor中で機械的に解離した後、complete EpiLife® medium（EpiLife Defined Growth Supplementsおよび0.06 mM Ca2+を含む）にて、35 mm dishあたり3.0–4.0 × 10^5 cellsで播種した。播種4日後、温度および5% CO2を制御したチャンバー内でKeyence BZ-X710顕微鏡を用い、time-lapse位相差撮像を実施した。画像は×4 PlanFluor NA0.13 PhL対物レンズを用い、15 minごとに24 h（96フレーム）取得し、その後解析用に動画へ変換した。細胞情報を盲検化した2名の情報科学者が、解析対象コロニーを無作為に選定した。OFでは、Farnebäckアルゴリズム（OpenCV ver.3.4；neighbourhood 5 × 5 pixels；その他はデフォルト）により連続フレーム間のピクセルごとの変位ベクトルを生成した。予備的な背景測定に基づき、MS ≥ 1.00 pixel/frameのピクセルを細胞／コロニー領域として扱った（背景のMS最大0.57 pixels/frame；細胞／コロニーのMS最小1.12 pixels/frame）。MSは、スケール1.875 μm/pixel（100-μm bar = 53.3333 pixels）とフレーム間隔15 min（7.5倍）を用いてμm/hへ換算し、MMSは全フレームにわたるMSの平均とした。NCCでは、template matchingにより手動でマーキングしたコロニー領域をフレーム間で追跡し、DIをフレーム間の非類似度（NCC係数に基づく）から算出し、MDIは全フレームにわたるDIの平均とした。増殖能は、time-lapse終了24 h後（培養合計144 h）に細胞を固定し、dishをスキャンしたうえで、対象コロニーの細胞数をtime-lapse最初のフレームと終点で手動カウントし、PDをlog2(N/N0)として算出した。PDとMMS/MDIのPearson相関係数はExcelで計算した。

本研究は、口腔keratinocyteの細胞／コロニー運動が、標準的なtime-lapse位相差顕微鏡画像から、カスタムソフトウェアに実装した2つの既存computer-vision手法を用いて非侵襲的に定量化できることを示した。コロニー単位の運動パラメータ（OFからのMMS、NCCからのMDI）を定義することで、培養初期にラベル不要で導出可能な2つの定量指標を提示し、これらが個々のコロニーにおける増殖能（PD）と統計学的に有意な正の関連を示すことを示した。本研究は、破壊的な分子アッセイや標準化されていない技術者判断よりも、再生医療製造の制約に適合したQC手法へ向けた予備的ステップとして位置づけられている。重要な概念的貢献として、感度の異なる2つの相補的アルゴリズムを用い、互いの弱点を補い得る点が挙げられる。すなわちOFは、輪郭が複雑で対象を明確にセグメンテーションできない状況に有利とされる一方、NCCのtemplate matchingは、大きな変位が生じる場合により頑健だが、輪郭変化を伴わない純粋な並進運動には鈍感である可能性が述べられている。著者らは、単一パラメータに依存するよりも両指標を併用することで、より堅牢なモニタリングが可能になると主張し、さらに（本研究で定義した）DIは速度とは異なる運動関連指標として、QC目的のより多面的な評価を可能にするとしている。

著者らは、QCツールとして臨床導入する前に必要な方向性を複数示している。第一に、過大評価の可能性を減らし、多様な運動様式をよりよく捉えるための技術的改良が必要である。口腔keratinocyteは並進だけでなく回転も起こり得るが、現行手法では細胞輪郭が類似したままの回転運動を定量できない可能性がある。また、細胞分裂の際には一過性に縮小したり運動が停止したりすることがあるため、OFとNCCのいずれも細胞分裂ダイナミクスを精密には捉えられない可能性が指摘されている。第二に、2D位相差画像系列を用いることの大きな限界として、実際の細胞運動は三次元であり、本実装ではz軸方向のダイナミクスを解析できない点が挙げられる。OFとNCCを3D画像系列に対応させることが究極的な目標とされ、細胞追跡のための新興のlabel-free 3D imaging systemsの活用可能性が示されている。第三に、スケーラビリティ上の制約として、培養がconfluentに近づくと個別コロニーのサンプリングと追跡が困難になり、現行のコロニー基盤プロトコルは培養後期に全細胞集団を評価する用途には不適であると認めている。これに対応して、臨床的に現実的なQCワークフローの中で不良な細胞集団を同定・除去できるよう、MMSとMDI（および持続時間、面積、タイミングを組み込んだ関連指標）を用いたvessel-levelの測定プロトコルを開発・検証することが提案されている。最後に、「substandard」な細胞の判定基準は、MMS/MDIを長期増殖や上皮再生能などの機能的keratinocyteアウトカムと結び付けて確立する必要があり、さらに運動と増殖能の間の分子レベルの関連を明らかにする機序研究が必要である、と述べている。

皮ふや角膜などの上皮を、患者さん自身の細胞から「シート状」に作って移植する医療が進んでいます。こうした治療で効果を出すには、培養している間に、治療に特に重要な細胞（増え続ける力が高い細胞の集団）がきちんと保たれているかを確認する必要があります。そのため、製造中に使える信頼性の高い品質管理(製造している細胞や組織が、決められた品質を満たしているかを確認する仕組みです。安全性と効果を担保するために欠かせません。)が求められています。
しかし、これまでよく使われてきた細胞の評価法（遺伝子やタンパク質を調べる方法など）は、細胞を壊して調べる必要があるため、移植に使う細胞を無菌のままリアルタイムで見守る目的には向きません。その結果、現場では熟練者の目視チェックに頼りがちですが、これは数値で比べにくく標準化もしにくい問題があります。
そこで本研究は、口の中の上皮細胞である口腔ケラチノサイトについて、タイムラプス顕微鏡(一定時間ごとに連続撮影して、細胞の動きや変化を動画のように観察する方法です。培養中の変化を追えるのが利点です。)画像だけから、染色などをせずに細胞やコロニーの動きを数値化し、その数値で「増える力（増殖能(細胞が増えていく能力のことです。治療に使う細胞では、必要な細胞数を確保できるかや、性質の良い細胞が残っているかに関係します。)）」を評価できる方法を作り、確かめることを目的にしました。具体的には、画像解析の方法としてoptical flow(連続する画像の明るさの変化から、画面上の各点がどの方向にどれだけ動いたかを推定する画像解析法です。形が複雑で境界がはっきりしない対象でも動きを捉えやすい点が重要です。)とnormalised cross-correlation(2つの画像（または画像の一部）がどれだけ似ているかを数値化する方法です。明るさの変動に強く、追跡や照合に広く使われます。)の2つを使い、コロニーごとの動きの指標であるMMS(コロニーの動く速さを表す指標で、複数フレームのmotion speedを平均したものです。培養初期にコロニーの状態を数値で比べるのに役立ちます。)とMDI(コロニーの動きによる「見え方の変化」の大きさを表す指標で、dynamic indexを平均したものです。速さとは別の角度から動きを評価できる点が重要です。)を計算し、これらと増殖能の関係を調べました。

ヒトの初代口腔ケラチノサイトのコロニーをタイムラプスで撮影した位相差画像(染色しなくても、生きた細胞を見やすくする顕微鏡画像の方式です。細胞を傷つけにくい観察に向きます。)から、コロニーの動きを表す2つの数値を計算できました。optical flow(連続する画像の明るさの変化から、画面上の各点がどの方向にどれだけ動いたかを推定する画像解析法です。形が複雑で境界がはっきりしない対象でも動きを捉えやすい点が重要です。)からは動く速さ（MS(optical flowで推定した、フレーム間での動きの速さです。コロニーの運動性を直接的に表します。)）を、normalised cross-correlation(2つの画像（または画像の一部）がどれだけ似ているかを数値化する方法です。明るさの変動に強く、追跡や照合に広く使われます。)からは動きの大きさを反映する指標（DI(normalised cross-correlationにもとづき、連続フレーム間でコロニーがどれだけ変化したか（似ていなさ）を表す値です。移動や形の変化などをまとめて反映し得ます。)）を求め、各コロニーについて平均したものをそれぞれMMS(コロニーの動く速さを表す指標で、複数フレームのmotion speedを平均したものです。培養初期にコロニーの状態を数値で比べるのに役立ちます。)とMDI(コロニーの動きによる「見え方の変化」の大きさを表す指標で、dynamic indexを平均したものです。速さとは別の角度から動きを評価できる点が重要です。)としました。
3つの代表的なコロニーでは、MMSは約35、30、28 μm/hourで、MDIは約0.58、0.54、0.40でした。MMSが高いコロニーほどMDIも高く、順位づけは一致しました。
また、optical flowで求めた速さは、細胞を手作業で追跡した結果と比べて確かめられました。DIについても、細胞やコロニーの移動が速いほどDIが大きくなる傾向が示され、動きに関係する指標として使えることが支持されました。
さらに、コロニーの増殖能(細胞が増えていく能力のことです。治療に使う細胞では、必要な細胞数を確保できるかや、性質の良い細胞が残っているかに関係します。)をPDで表して比べたところ、MMSとMDIはいずれもPDと「正の相関（高いほど高い）」を示し、統計的にも有意でした。つまり、この条件では、よく動くコロニーほど増える力も高い可能性が示されました。

口腔粘膜のサンプルは、倫理審査の承認と本人の同意のもとで入手しました。そこから初代の口腔ケラチノサイトを培養し、継代培養も行いました。
細胞は培養皿に播種し、播種4日後に、温度とCO2濃度を管理できる顕微鏡装置で位相差のタイムラプス撮影を行いました。15分ごとに24時間撮影し、合計96枚の画像を得て動画として解析しました。解析対象のコロニーは、細胞の情報を知らない2名が無作為に選びました。
optical flow(連続する画像の明るさの変化から、画面上の各点がどの方向にどれだけ動いたかを推定する画像解析法です。形が複雑で境界がはっきりしない対象でも動きを捉えやすい点が重要です。)ではFarnebäck法を使って連続する画像間のピクセルの動きを計算し、そこから速さMS(optical flowで推定した、フレーム間での動きの速さです。コロニーの運動性を直接的に表します。)を求め、全時間の平均をMMS(コロニーの動く速さを表す指標で、複数フレームのmotion speedを平均したものです。培養初期にコロニーの状態を数値で比べるのに役立ちます。)としました。normalised cross-correlation(2つの画像（または画像の一部）がどれだけ似ているかを数値化する方法です。明るさの変動に強く、追跡や照合に広く使われます。)ではテンプレートマッチングでコロニー領域を追跡し、隣り合うフレーム間での「似ていなさ」からDI(normalised cross-correlationにもとづき、連続フレーム間でコロニーがどれだけ変化したか（似ていなさ）を表す値です。移動や形の変化などをまとめて反映し得ます。)を計算し、その平均をMDI(コロニーの動きによる「見え方の変化」の大きさを表す指標で、dynamic indexを平均したものです。速さとは別の角度から動きを評価できる点が重要です。)としました。
増殖能(細胞が増えていく能力のことです。治療に使う細胞では、必要な細胞数を確保できるかや、性質の良い細胞が残っているかに関係します。)は、タイムラプス終了後にコロニーの細胞数を最初と最後で数え、PD = log2(N/N0)で計算しました。PDとMMS/MDIの関係はPearson相関(2つの数値の関係がどれくらい一直線の傾向を持つかを表す統計指標です。品質指標と増殖能の関係を客観的に評価するのに使います。)で評価しました。

本研究は、標準的な位相差タイムラプス画像から、染色などをせずに口腔ケラチノサイトの細胞／コロニーの動きを数値化できることを示しました。optical flow(連続する画像の明るさの変化から、画面上の各点がどの方向にどれだけ動いたかを推定する画像解析法です。形が複雑で境界がはっきりしない対象でも動きを捉えやすい点が重要です。)によるMMS(コロニーの動く速さを表す指標で、複数フレームのmotion speedを平均したものです。培養初期にコロニーの状態を数値で比べるのに役立ちます。)と、normalised cross-correlation(2つの画像（または画像の一部）がどれだけ似ているかを数値化する方法です。明るさの変動に強く、追跡や照合に広く使われます。)によるMDI(コロニーの動きによる「見え方の変化」の大きさを表す指標で、dynamic indexを平均したものです。速さとは別の角度から動きを評価できる点が重要です。)という2つの指標は、培養初期に計算でき、しかもコロニーの増殖能(細胞が増えていく能力のことです。治療に使う細胞では、必要な細胞数を確保できるかや、性質の良い細胞が残っているかに関係します。)（PD）と正の関係がありました。
この方法は、細胞を壊して調べる検査や、標準化しにくい目視判断よりも、再生医療の製造現場で求められる「非侵襲で定量的な品質管理(製造している細胞や組織が、決められた品質を満たしているかを確認する仕組みです。安全性と効果を担保するために欠かせません。)」に近い考え方を提供します。さらに、2つの解析法を併用することで、片方の弱点をもう片方が補える可能性があり、より安定したモニタリングにつながると考えられます。またDI(normalised cross-correlationにもとづき、連続フレーム間でコロニーがどれだけ変化したか（似ていなさ）を表す値です。移動や形の変化などをまとめて反映し得ます。)は「速さ」そのものとは違う情報を出せるため、多面的な評価にも役立つとされています。

臨床で品質管理(製造している細胞や組織が、決められた品質を満たしているかを確認する仕組みです。安全性と効果を担保するために欠かせません。)ツールとして使うには、改善すべき点が示されています。
まず、口腔ケラチノサイトは移動だけでなく回転も起こり得ますが、現在の方法では輪郭があまり変わらない回転運動をうまく数値化できない可能性があります。また、細胞分裂のときは一時的に縮んだり止まったりするため、分裂の動きを正確に捉えにくい点も課題です。
次に、位相差の2次元画像だけでは、実際の細胞運動の3次元性（奥行き方向）を解析できません。将来的には3D画像に対応させることが目標です。
さらに、培養が進んで細胞が密になってくると、個別コロニーを追跡して評価することが難しくなります。そのため、培養容器全体（vessel-level(1つ1つのコロニーではなく、培養容器全体を単位として細胞集団の状態を評価する考え方です。臨床製造のような大規模培養で現実的になります。)）で不良な細胞集団を見つけて除外できるような、より現場向けの測定方法の開発が提案されています。最後に、「基準未満の細胞」をどう決めるかは、MMS(コロニーの動く速さを表す指標で、複数フレームのmotion speedを平均したものです。培養初期にコロニーの状態を数値で比べるのに役立ちます。)/MDI(コロニーの動きによる「見え方の変化」の大きさを表す指標で、dynamic indexを平均したものです。速さとは別の角度から動きを評価できる点が重要です。)を長期増殖や上皮の再生能力などの機能と結び付けて、基準を作る必要があるとされています。