卵巣子宮内膜症におけるKRAS変異アリル発現の生物学的意義

子宮内膜症は生殖年齢の女性の10%～15%に影響し、相当な罹患負担（例：慢性骨盤痛、月経困難症、不妊）を伴うほか、悪性化、特に卵巣明細胞癌および卵巣類内膜癌への移行が臨床的に懸念されている。著者らの先行研究を含む近年のゲノム研究により、**KRAS**や**PIK3CA**などのがん関連オンコジーンが、子宮内膜症（卵巣子宮内膜症を含む）だけでなく正常子宮内膜でも高頻度に変異していることが示されている。とりわけ卵巣子宮内膜症では**KRAS**のホットスポット変異が一般的で、**KRAS p.G12V (c.G35T)**が最も頻度の高い変化として以前に同定されていた。しかし、これらの変異の生物学的意味は不確かだった。というのも、DNA/RNAのペア解析に十分な上皮成分を得ることが技術的に難しく、良性の子宮内膜症上皮において変異KRASがmRNAレベルで実際に発現しているかが不明だったためである。この空白を、空間情報を保ったまま埋めるために、本研究は(i) FFPE検体で**KRAS p.G12V**変異アレル発現を検出するRNAベースのin situハイブリダイゼーション法を検証し、(ii) それを卵巣子宮内膜症に適用して、変異アレル発現が起こるか、および空間的不均一性を示すかを明らかにすることを目的とした。

検証実験全体を通して、RNAベースのin situハイブリダイゼーションアッセイは、既知のDNAレベルの変異状態と整合するアレル特異的発現を検出した。がん細胞株では、**KRAS p.G12V**プローブのシグナルは**KRAS p.G12V**変異を持つ細胞株にのみ認められ（ホモ接合／ヘテロ接合の状態と一致するパターンを含む）、**KRAS wild-type**の細胞株では変異プローブのシグナルは認められなかった。KRAS状態が事前に確立している卵巣がんFFPE検体9例では、**KRAS p.G12V**変異シグナルは上皮性腫瘍細胞で観察され、間質細胞では観察されなかった。また変異プローブは**KRAS p.G12D (c.G35A)**検体とは交差反応しなかった。卵巣子宮内膜症に本アッセイを適用すると、変異アレル発現は、後ろ向きに選定した**4/6**例（凍結組織では以前にKRAS p.G12Vを有していたが、FFPEは別病変由来）で子宮内膜症上皮細胞に可視化され、前向きに収集した症例では**6/20 (30.0%)**で認められた。レーザーマイクロダイセクションに基づく標的遺伝子シーケンスが利用可能だった12例では、in situの結果はシーケンスと一致し、シグナル陽性**5**例は全て**KRAS p.G12V**であった一方、シグナル陰性**7**例のうち**5**例はKRAS wild-typeで、**2**例は他のKRAS変異を有していた。臨床的には、小規模なKRAS wild-type群（n=5）と比べて、**KRAS p.G12V発現群（n=10）**は術前の炎症マーカーが高く、**CRPは有意に高値（P = .024）**であり、**rASRMスコアが高い傾向（P = .053）**がみられた。空間的には、シグナル陽性の子宮内膜症症例の多くは均一だったが、**2/10**では腫瘍内不均一性が認められ、wild-typeのみ、混在、変異優位のシグナルが主体の領域が存在した。これらの領域は**p-ERK**染色強度にも対応した差（変異シグナルが優位な領域でより強い）を示し、病変内でRaf/MEK/ERK経路の活性化が可変であることと整合した。

本研究は、FFPE切片で一塩基変異（single-nucleotide variants）を識別するため、**BaseScopeTM**を中心としたRNAベースのin situ変異検出ワークフローを開発・適用した。まず、5種類のヒトがん細胞株の変異状態を**Sanger sequencing**で確認し、in situ解析用にセルブロックを作製した。in situアッセイでは4種類のプローブ（**KRAS p.G12V**変異プローブ、対応する**KRAS wild-type**プローブ、陽性／陰性コントロールである**PPIB**と**dapB**）を使用した。シグナルは赤いドットとして可視化し、スライドあたり5視野で陽性細胞の割合を定量した。臨床検証として、既存シーケンスでKRAS状態が既知の卵巣癌FFPE 9例について、in situアッセイに用いた切片に隣接する連続FFPE切片からSanger sequencingで再確認し、さらに交差反応性の評価のため**KRAS p.G12D**症例でプローブ特異性を検証した。子宮内膜症コホートは**卵巣子宮内膜症FFPE 26例**（後ろ向き6例、前向き20例）で、婦人科病理専門医が組織学的レビューを行った。in situ所見とDNAレベルの変化の対応付けおよび不均一性評価のため、著者らは上皮領域（変異シグナル優位とwild-typeシグナルのパターン）を**laser microdissection**で切り出し、DNAを抽出した。子宮内膜症検体12例を選定して**76遺伝子の標的遺伝子シーケンス**を実施し（平均深度**109.7 reads**、**99.0%**で20リード以上のカバレッジ）、解釈は**KRAS**のホットスポットコドン12、13、61に重点を置いた。経路の指標として、連続切片で**phospho-ERK (Thr202/Tyr204)**の免疫組織化学を行った。シグナルパターンの空間マッピングにはデジタル化したスライド画像と、事前に定義した領域ルール（例：≥50細胞による分離）を用い、**2.0%**の陽性カットオフにより領域をwild-typeのみ、混在、変異優位に分類した。統計比較にはRで**Fisher’s exact test**と**Wilcoxon rank-sum test**を用いた。KRASアレル発現の確認のため、選定した卵巣がん細胞株およびがん検体でRNA sequencingを行った。子宮内膜症ではRNAの質・量が低くRNA-seqが実施困難であったため、子宮内膜症上皮にKRAS mRNAが存在することの確認として追加で**RNAscope®**を使用した。

本研究は、卵巣子宮内膜症の上皮細胞において**KRAS p.G12V変異アレルが転写されている**ことの直接的証拠を提示し、従来のDNAレベルの変異調査によって生じていた重要な不確実性に答えた。細胞株と卵巣がん組織でアレル特異的in situ法を検証した上で卵巣子宮内膜症に適用することにより、バルクRNA抽出を必要とせず、形態学的・空間的文脈を保ったまま、日常診療で用いられる**FFPE**検体で変異アレル発現を検出できることを示した。生物学的に注目すべき含意として、少なくとも一部の病変ではKRAS変異サブクローンが発現の**空間的不均一性**を示し、その不均一性が同一スライド上の**p-ERK**染色の差と整合していた。これは、in situでのKRAS活性化と下流のMAPK経路活性化との関連を支持する。臨床指向の解析では、**KRAS p.G12V発現**と炎症マーカー（特に高い**CRP**）との関連、ならびに病変重症度（**rASRMスコア**高値傾向）との関連の可能性も示唆されたが、比較群は小規模であり、著者らは複数の所見を確定的な効果ではなく傾向として解釈している。総じて本研究は、上皮成分が限られ従来のゲノム／トランスクリプトーム解析が制約されがちな子宮内膜症において、RNAベースのin situ変異検出が、オンコジーン変異を研究し、将来的にはモニタリングするための実用的アプローチになり得ることを示した。

著者らは、RNAベースのin situ変異検出が、標的細胞が乏しい組織でも臨床的に重要な変異プロファイリングを可能にし、上皮区画でRASのオンコジーン変化（**KRAS p.G12V**を含む）を直接検出することで、子宮内膜症の再発リスクや悪性化リスクの評価に資する可能性があると述べている。一方で、プローブ間の感度差の可能性や、臨床検体では細胞株よりドット数が一般に少ないことを踏まえ、BaseScopeTMを用いて変異アレルとwild-typeアレルの発現を**定量的**に比較するためには、さらなる方法論の改善が必要だと強調している。生物学的には、RAS変異は下流表現型が異なり得るため、変異したアミノ酸の違いを考慮しつつ、ゲノム情報とトランスクリプトーム情報を組み合わせた空間分解能のある解析が重要になると提案している。また炎症を有望な機序的方向性として挙げ、臨床相関と外部の発現解析（公表されたトランスフェクションデータセットに対するGSEA）から、オンコジーンKRASが炎症関連経路と結び付く可能性が示唆されることを踏まえ、KRAS駆動性の炎症シグナルが病変進行や悪性化にどのように寄与し得るかを明らかにする今後の研究が動機付けられるとしている。最後に、著者らが引用したマウスモデルの証拠とも整合して、**KRAS活性化単独では悪性化に不十分な可能性**がある点を指摘し、今後はKRAS変異アレル発現を追加の異常（例：PTEN loss、ARID1A changes）と組み合わせて検討し、良性子宮内膜症と卵巣がんの間でクローン増殖や空間的均一化がどのように異なるかを調べるべきだとしている。

子宮内膜症(本来は子宮の内側にある組織に似たものが、卵巣など子宮の外で増える病気です。痛みや不妊の原因になり、まれにがんと関係することもあります。)は、妊娠できる年齢の女性の10%〜15%にみられる病気で、慢性的な骨盤の痛み、強い生理痛、不妊などの原因になります。さらに、一部はがんに進む可能性も心配されており、特に卵巣の明細胞がんや類内膜がんとの関係が注目されています。
最近の研究で、KRAS(細胞が増える・生き残るための信号を伝える遺伝子で、多くのがんで変化が見つかります。)やPIK3CA(細胞の増殖や生存に関わる信号経路に関係する遺伝子で、がんや一部の良性病変でも変化が見つかることがあります。)のような「がんに関わる遺伝子」の変化が、子宮内膜症だけでなく正常な子宮内膜にもよく見つかることが分かってきました。特に卵巣の子宮内膜症では、KRASという遺伝子の特定の変化がよく起こり、その中でもKRAS p.G12Vが多いとされていました。
しかし、遺伝子が変化していても、その変化した遺伝子が細胞の中で実際に働く形（mRNA(遺伝子の情報をタンパク質づくりに伝えるための分子です。mRNAが作られることは、その遺伝子が細胞内で使われていることを意味します。)として作られること）になっているのかは、はっきりしていませんでした。理由は、子宮内膜症の病変では調べたい上皮細胞(体の表面や臓器の内側をおおう細胞で、子宮内膜症では病変の中心となる細胞の一つです。)が少なく、DNAとRNAの両方を十分に取り出して調べるのが難しいからです。
そこで本研究は、保存された検体（FFPE(手術などで取った組織をホルマリンで固定し、パラフィンに埋めて保存した検体です。病院でよく使われます。)）を使い、組織の位置情報を保ったままKRAS p.G12VがmRNAとして作られているかを見える形で確かめる方法を確認し、それを卵巣子宮内膜症に使って、発現が起きているか、場所によって違いがあるかを調べることを目的にしました。

RNAを組織内で直接調べる方法により、DNAで分かっていたKRAS(細胞が増える・生き残るための信号を伝える遺伝子で、多くのがんで変化が見つかります。)の変化と一致する形で、変化したKRASの発現を検出できました。がん細胞の実験では、KRAS p.G12Vを持つ細胞だけで反応が出て、KRASに変化がない細胞では反応が出ませんでした。
卵巣がんの検体でも、KRAS p.G12Vの反応は主に上皮のがん細胞で見られ、周りの間質ではほとんど見られませんでした。また、別の変化であるKRAS p.G12Dには誤って反応しないことも確認されました。
卵巣子宮内膜症(本来は子宮の内側にある組織に似たものが、卵巣など子宮の外で増える病気です。痛みや不妊の原因になり、まれにがんと関係することもあります。)では、後ろ向きに選んだ6例中4例、前向きに集めた20例中6例（30%）で、子宮内膜症の上皮細胞(体の表面や臓器の内側をおおう細胞で、子宮内膜症では病変の中心となる細胞の一つです。)にKRAS p.G12Vの発現が見える形で確認されました。別の方法でDNAを調べられた症例では、見え方の結果とDNAの結果が一致し、反応が出た例はすべてKRAS p.G12Vでした。
さらに、KRAS p.G12Vが発現している群は、KRASに変化がない群よりも炎症の指標が高く、特にCRP(体の炎症の強さを反映する血液検査の値で、感染や炎症で上がります。)が高いことが示されました。また、病変の重さを表すrASRMスコア(子宮内膜症の重症度を、病変の広がりや癒着などで点数化する基準です。)も高い傾向がありました。
場所による違いについては、多くの症例ではほぼ同じように見えましたが、一部（10例中2例）では、同じ病変の中でも「変化がない部分」「混ざっている部分」「変化したものが多い部分」が分かれて存在していました。こうした違いはp-ERK(ERKという分子が活性化した状態を示す目印で、信号経路が動いているかを推測するのに使われます。)の染色の強さの違いとも対応しており、細胞内の信号の働き方が場所によって変わる可能性が示されました。

保存された組織（FFPE(手術などで取った組織をホルマリンで固定し、パラフィンに埋めて保存した検体です。病院でよく使われます。)）上で、たった1文字のDNAの違いに対応するRNAの違いを見分けるために、BaseScopeTM(短いRNA配列を狙って検出でき、1文字の違い（変異）も見分けやすいin situの検査技術です。)というRNAを組織内で検出する方法を中心に手順を作りました。
まず、がん細胞株でKRAS(細胞が増える・生き残るための信号を伝える遺伝子で、多くのがんで変化が見つかります。)の変化を確かめたうえで、KRAS p.G12V用のプローブ(特定のRNAやDNAにだけ結びつくように作った目印の分子で、目的の遺伝子を見つけるために使います。)、KRASに変化がない場合用のプローブ、そして検査が正常に働いているか確認するための対照プローブを使いました。反応は赤い点として見え、複数の視野で陽性細胞の割合を数えました。
臨床検体では、KRASの状態が分かっている卵巣がん検体で方法の正確さを確認し、別変化（KRAS p.G12D）に誤反応しないことも調べました。
卵巣子宮内膜症(本来は子宮の内側にある組織に似たものが、卵巣など子宮の外で増える病気です。痛みや不妊の原因になり、まれにがんと関係することもあります。)の検体では、必要に応じてレーザーで上皮の一部を切り出してDNAを取り出し、複数の遺伝子を調べるシーケンスで、組織内の結果とDNAの結果が合うかを確かめました。加えて、p-ERK(ERKという分子が活性化した状態を示す目印で、信号経路が動いているかを推測するのに使われます。)の免疫染色で、細胞内の信号経路の活性化の違いも確認しました。

本研究は、卵巣子宮内膜症(本来は子宮の内側にある組織に似たものが、卵巣など子宮の外で増える病気です。痛みや不妊の原因になり、まれにがんと関係することもあります。)の上皮細胞(体の表面や臓器の内側をおおう細胞で、子宮内膜症では病変の中心となる細胞の一つです。)でKRAS(細胞が増える・生き残るための信号を伝える遺伝子で、多くのがんで変化が見つかります。) p.G12Vが「遺伝子の変化としてある」だけでなく、「mRNA(遺伝子の情報をタンパク質づくりに伝えるための分子です。mRNAが作られることは、その遺伝子が細胞内で使われていることを意味します。)として実際に作られている」ことを直接示しました。
また、FFPE(手術などで取った組織をホルマリンで固定し、パラフィンに埋めて保存した検体です。病院でよく使われます。)検体を使い、組織の形や位置関係を保ったまま変化した遺伝子の発現を検出できることを示した点も重要です。さらに一部の症例では、同じ病変の中でもKRASの発現が場所によって違い、その違いがp-ERK(ERKという分子が活性化した状態を示す目印で、信号経路が動いているかを推測するのに使われます。)の強さとも対応していました。これは、KRASの変化が下流の信号経路の働き方に影響している可能性を支持します。
ただし、炎症マーカーや病変の重さとの関係は、比較する人数が少ないため「確定」ではなく「傾向」として慎重に扱う必要があります。

この方法が発展すれば、細胞数が少ない組織でも、重要な遺伝子の変化を調べやすくなり、子宮内膜症(本来は子宮の内側にある組織に似たものが、卵巣など子宮の外で増える病気です。痛みや不妊の原因になり、まれにがんと関係することもあります。)の再発やがん化のリスク評価に役立つ可能性があります。
一方で、変化した型と変化していない型の発現量を正確に比べるには、検出の感度差などを改善する必要があります。
また、KRAS(細胞が増える・生き残るための信号を伝える遺伝子で、多くのがんで変化が見つかります。)の変化の種類によって細胞の反応が変わる可能性があるため、DNAの情報とRNAの情報を合わせ、位置情報も含めて解析することが大切だとされています。炎症との関係も重要なテーマで、KRASが炎症に関わる仕組みを通じて病変の進行やがん化にどう影響するのか、今後の研究が求められます。さらに、KRASの活性化だけではがん化に足りない可能性があるため、PTEN(細胞増殖を抑える働きがある遺伝子で、失われるとがん化に関わりやすくなります。)やARID1A(遺伝子の働き方を調整する仕組みに関係する遺伝子で、卵巣の一部のがんや関連病変で異常が見つかります。)など他の異常と組み合わせて調べることも必要だと述べられています。