腸-肝連関を介したセロトニンの非アルコール性脂肪肝の病態への関与

非アルコール性脂肪性肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD）は有病率が増加しており（世界的に約30%と報告）、非アルコール性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis: NASH）、線維化、さらに合併症へと進行しうる。腸内細菌叢（microbiota）の変化、短鎖脂肪酸（short-chain fatty acids: SCFAs）、腸管タイトジャンクション（tight junction）機能障害など、多くの候補機序が議論されてきた一方で、著者らは、これらの因子を結び付ける病態ネットワークが十分に定義されていないことが標準治療の欠如につながっていると主張する。自律神経経路が臓器間コミュニケーションを介して肝再生や肝脂質変化に影響することを示した先行研究を踏まえ、本研究は、自律神経のシグナル伝達がNAFLD/NASHの発症と進行に直接関与するかを検討することに焦点を当てた。著者らは特に、腸―肝の神経軸（gut–liver neural axis）がNAFLD/NASHに影響し、主として腸で産生される消化管ホルモンであるserotoninが、肝由来の自律神経シグナルの下流で作用するエフェクターとして機能する、という仮説を立てた。choline-deficient defined L-amino-acid（CDAA）および高脂肪食（high-fat diet: HFD）のマウスモデルを用い、神経遮断と薬理学的なserotonin受容体拮抗が、肝脂肪化、線維化、腸管タイトジャンクション蛋白、microbiota組成、SCFAs、腸のserotonin発現に与える影響を評価した。

capsaicinによるdeafferentation（求心性遮断）を用いて、肝由来の自律神経の求心性交感神経シグナル伝達を遮断すると、両NAFLDモデルで疾患所見が軽減した。神経遮断は、摂食量を変えずにHFD給餌マウスの体重増加を低下させ（P<0.001）、またCDAA給餌マウスでは4週間以内に肝重量増加（LW/BW比に反映）を低下させた（P<0.01）。組織学的には、内臓神経遮断により肝脂肪化が抑制され、CDAA給餌マウスでは4週および8週（いずれもP<0.01）、HFD給餌マウスでは4週（P<0.05）および8週（P<0.01）で抑制が認められた。線維化も減少し、CDAA給餌マウスでは4週にSirius Red面積とhydroxyprolineで低下した（いずれもP<0.01）が、8週ではこの効果は明確ではなかった。HFD給餌マウスでは、線維化抑制は4週（組織学 P<0.001；hydroxyproline P<0.05）および8週（組織学 P<0.05；hydroxyproline P<0.05）で持続した。並行して遮断は腸管タイトジャンクション蛋白（Claudin-1およびZo-1）の発現を増加させ、特に4週で顕著で、8週ではsham水準へ部分的に回復する傾向がみられた。microbiota解析では、神経遮断が細菌学的特徴を部分的に「正常化」することが示され、CDAAで誘導されるBacteroidetes/Firmicutes比の上昇を4週で低下させ（P<0.05）、またCDAA群・HFD群の両方で4週のShannon多様性を改善した（P<0.05）。8週では効果は弱かった。SCFAの回復はモデル依存で、CDAA給餌マウスでは8週に総SCFAs、酢酸、酪酸が遮断により増加した（すべてP<0.05）のに対し、HFD給餌マウスではSCFAsに有意な変化はなかった。機序に関して、CDAAとHFDはいずれもenterochromaffin細胞におけるserotoninとTph1 mRNAを増加させ、神経遮断は4週で両者を抑制した（serotonin免疫染色 P<0.01；Tph1 P<0.05）。最後に、主に腸で作用する5-HT3 receptor antagonistであるtropisetronは、4週間で主要効果を再現（phenocopied）し、HFDでの体重増加を低下（P<0.01）、肝脂肪化を低下（両食餌でP<0.01）、線維化を低下（CDAA P<0.01；HFD P<0.05）、Claudin-1とZo-1発現を増加させた（Claudin-1は両方でP<0.01；Zo-1は両方でP<0.05）。これらは、この軸における媒介因子としてのserotoninシグナルを支持する。

雄C57BL/6JJclマウス（n=120；8週齢、20–25 g）を管理された環境で飼育し、体重と摂食量を毎日モニタリングした。10週齢で、sham手術または、露出したceliac artery周囲に局所cap-saicin（オリーブ油中50 mg/ml）を30分適用することにより、肝からの求心性交感神経線維の化学的deafferentationを行った。遮断の有効性はcalcitonin gene-related peptide（CGRP/Calca）染色で追跡し、4週で最大24%低下（P<0.01）し、8週では部分的回復（0週比で48%の遮断；P<0.05）が示された。手術後、マウスを4週または8週の食餌に割り付けた：対照食（Cnt）、CDAA食（0.1% methionine；脂肪62% kcal、蛋白18% kcal、炭水化物20% kcal）、またはHFD（脂肪60% kcal、蛋白20% kcal、炭水化物20% kcal）。serotonin関与を独立に検証するため、別のCDAAおよびHFDコホートに対し、飲水中にtropisetronを投与して経口で約0.2 mg/kg/dayとなるようにし、4週間継続した。4週および／または8週で肝臓と小腸組織を採取し、組織学（脂肪化にH&E、線維化にSirius Red）と免疫組織化学（serotonin、Claudin-1、Zo-1、CGRP、F4/80、Foxp3）を行い、ImageJで定量画像解析を実施した。線維化は肝hydroxyprolineでも追加定量した。血清生化学はammonia、AST、ALT、ALP、LDH、T-CHO、TGを含んだ。腸のTph1 mRNAはqRT-PCR（2−ΔΔCt；Gapdhで正規化）で測定した。microbiota組成は盲腸便から16S rRNA ampliconsのterminal restriction fragment length polymorphism（T-RFLP）によりプロファイルし、多様性はShannon indexなどの指標で評価した。便中SCFAsは炎イオン化検出器を用いたガスクロマトグラフィーで定量した。統計解析はANOVA枠組み（必要に応じてBonferroni補正）、Student’s t-test、Rによるmicrobiome特異的検定を用い、P≤0.05を有意とした。

著者らは、肝臓からの自律神経シグナル伝達が、CDAAおよびHFD給餌の両マウスモデルにおけるNAFLD/NASH発症に機能的に関与し、腸のserotoninがこの腸―肝神経軸における主要なエフェクターであると結論づけた。求心性交感神経deafferentation（capsaicin）と、腸の5-HT3受容体拮抗（tropisetron）という2つの介入は収束的に、いずれも肝脂肪化と線維化を改善し、腸管タイトジャンクション蛋白発現を増加させた。さらに本研究は、これらの改善が腸内エコシステムの変化（microbiotaの組成／多様性、およびCDAAモデルではSCFAsの部分的回復）と関連することを示した。時間経過は著者らの解釈の中核であり、最も強い効果は神経遮断後4週で現れ、8週では弱まった。これはCGRP染色で示された神経シグナルの部分回復と整合する。これにより、継続する自律神経シグナルが疾患を単に開始するだけでなく進行にも寄与する、という主張が支持される。著者らは、これらのモデルにおいて、消化管ホルモンのシグナル—具体的にはserotonin—が肝からの自律神経リレーを介してNAFLD/NASH病態に影響しうることを直接的に示した初の報告であると述べ、serotonin受容体依存的な調節を潜在的治療戦略として位置づける（ただし現時点の証拠はマウスに限定される点に言及している）。

本論文は、機序およびトランスレーショナルな解釈を強化するために、追加検討が必要な点を複数挙げている。第一に、結論はマウスモデルに基づくため、NASH発症におけるserotoninの役割をさらに検討すべきであり、補足解析で観察された炎症細胞浸潤との部分的関係も含めて評価する必要があると述べる。第二に、lipopolysaccharidesや血中のbacterial DNAの測定、ならびに便と血液の両方でのSCFA定量など、追加の測定が、serotoninシグナルと腸管バリア機能の直接的つながりを明確にし、serotonin拮抗が肝へ到達する腸由来因子をどのように変化させるかをより明確に定義するのに有用だと提案する。第三に、capsaicin誘導deafferentationが弱まるにつれて神経遮断効果も減弱したことから、関連する自律神経シグナルを持続的に遮断すればNAFLD進行に対するより長期の防御が得られる可能性があり、連続的な調節を可能にするアプローチが必要だと示唆する。最後に、tropisetronはすでに制吐薬として承認されていることから、ヒト組織サンプルを用いた追試によりトランスレーショナルな可能性を評価する重要性を強調する一方、本データに基づいてヒトでの有効性を主張するものではないとしている。

非アルコール性脂肪性肝疾患(お酒が原因ではないのに肝臓に脂肪がたまる病気の総称です。放置すると炎症や線維化が進むことがあり、生活習慣病とも関係が深いので重要です。)（NAFLD）は、お酒が原因ではないのに肝臓に脂肪がたまる病気で、世界で約30％の人にあると報告されています。NAFLDは、より重い非アルコール性脂肪肝炎(脂肪がたまるだけでなく、肝臓に炎症や細胞の傷みが起きている状態です。進行すると線維化や肝硬変につながりやすい点が重要です。)（NASH）や肝臓の線維化(肝臓が傷ついた後の修復が進みすぎて、硬い組織が増える変化です。進むほど肝臓が働きにくくなり、病気の重症度を示します。)（かたくなる変化）に進み、合併症につながることもあります。
これまで、腸内細菌の変化、短鎖脂肪酸(腸内細菌が食物繊維などから作る、酢酸や酪酸などの小さな脂肪酸です。腸の環境やバリア機能、体の代謝に関わるため重要です。)（腸内細菌が作る物質）、腸の壁のすき間をふさぐ仕組みの乱れなど、いろいろな原因候補が考えられてきました。しかし、それらがどうつながって病気を進めるのかという全体像がはっきりせず、標準的な治療が確立していないと著者らは考えました。
そこで本研究では、肝臓から出る自律神経(意識しなくても働く神経で、内臓の働きやホルモン分泌などを調整します。臓器どうしの情報のやりとりにも関わる点が重要です。)の信号が、腸と肝臓のつながりを通してNAFLDやNASHの発症や進行に関わるのかを調べました。特に、腸肝神経軸(腸と肝臓が神経の信号でつながり、互いに影響し合うという考え方です。腸の変化が肝臓の病気に影響する仕組みを説明する土台になります。)が病気に影響し、腸で主に作られるホルモンのserotonin(体内で働く物質の一つで、特に多くが腸で作られます。腸の動きや神経の働きに関わるだけでなく、本研究では肝臓の脂肪化や線維化に関わる可能性が示されました。)がその働き手になる、という考えを立てました。マウスで2種類のNAFLDモデル食を使い、神経の信号を遮断する方法と、serotoninの受容体を薬で抑える方法が、肝臓や腸、腸内細菌などに与える影響を調べました。

肝臓から脳へ向かう自律神経(意識しなくても働く神経で、内臓の働きやホルモン分泌などを調整します。臓器どうしの情報のやりとりにも関わる点が重要です。)の信号をcapasaicinで遮断すると、2つのNAFLDモデルのどちらでも病気の程度が軽くなりました。
高脂肪食(脂肪の割合が非常に高い餌で、肥満や脂肪肝を起こしやすくするために使われます。人の生活習慣に近い形のモデルとして重要です。)（HFD）のマウスでは、食べる量は変わらないのに体重増加が抑えられました。また別の食事モデル（CDAA）では、肝臓の重さの増え方が早い段階で抑えられました。
肝臓の観察では、脂肪がたまる変化が神経遮断で減り、線維化(肝臓が傷ついた後の修復が進みすぎて、硬い組織が増える変化です。進むほど肝臓が働きにくくなり、病気の重症度を示します。)も減りました。ただし効果の出方には時間差があり、特に4週の時点で効果が強く、8週では弱まるものがありました。
さらに神経遮断により、腸の壁を守るタンパク質（Claudin-1やZo-1）が増え、腸のバリアが良くなる方向の変化が見られました。腸内細菌のバランスや多様性も一部で「正常に近づく」動きがありました。短鎖脂肪酸(腸内細菌が食物繊維などから作る、酢酸や酪酸などの小さな脂肪酸です。腸の環境やバリア機能、体の代謝に関わるため重要です。)はCDAAモデルでは回復が見られましたが、HFDモデルでは大きな変化がありませんでした。
また、CDAAとHFDはいずれも腸でのserotonin(体内で働く物質の一つで、特に多くが腸で作られます。腸の動きや神経の働きに関わるだけでなく、本研究では肝臓の脂肪化や線維化に関わる可能性が示されました。)産生を増やしましたが、神経遮断は4週でそれを抑えました。加えて、腸で働きやすいserotonin受容体（5-HT3）を抑える薬tropisetron(5-HT3受容体を抑える薬です。もともと吐き気を抑える薬として使われますが、本研究ではNAFLDの変化を軽くする方向の作用が示されました。)を4週間投与すると、体重増加の抑制、肝臓への脂肪のたまり方や線維化の改善、腸のバリア関連タンパク質の増加などが神経遮断と似た形で再現されました。これらの結果から、この仕組みの中心にserotoninの信号がある可能性が高いと考えられました。

8週齢の雄マウスを使い、体重と食べる量を毎日記録しました。10週齢で、手術をするだけの対照群（sham）と、capasaicinを使って肝臓から出る特定の神経の信号を弱める群に分けました。神経遮断が効いているかは、CGRP(神経の活動を示す目印として使われる物質です。本研究では、神経遮断がどれくらい効いているかを確認するために測定されました。)という目印になる物質の染色で確認しました。
その後、対照食、CDAA食(コリンが不足した特殊な餌で、マウスに脂肪肝や線維化を起こしやすくするために使われます。NAFLDやNASHのモデル作りに役立ちます。)、HFDのいずれかを4週または8週与え、肝臓と小腸を調べました。肝臓は脂肪のたまり方や線維化(肝臓が傷ついた後の修復が進みすぎて、硬い組織が増える変化です。進むほど肝臓が働きにくくなり、病気の重症度を示します。)を染色で評価し、線維化はhydroxyproline(コラーゲンに多く含まれる成分で、肝臓の線維化の量を数値で評価するために測ります。染色結果を別の方法で確かめるのに役立ちます。)の量でも確かめました。小腸ではserotonin(体内で働く物質の一つで、特に多くが腸で作られます。腸の動きや神経の働きに関わるだけでなく、本研究では肝臓の脂肪化や線維化に関わる可能性が示されました。)やバリア関連タンパク質を染色し、腸内細菌は16S rRNA(細菌が持つ遺伝子の一部で、どんな細菌がいるかを調べるときの手がかりになります。腸内細菌の構成を調べる基本的な方法に使われます。)を用いた方法で構成や多様性を評価しました。便中の短鎖脂肪酸(腸内細菌が食物繊維などから作る、酢酸や酪酸などの小さな脂肪酸です。腸の環境やバリア機能、体の代謝に関わるため重要です。)はガスクロマトグラフィー(混ざった物質を分けて量を測る装置・方法です。本研究では便中の短鎖脂肪酸を正確に測るために使われました。)で測定しました。
別のマウス群では、serotoninの関与を確かめるため、tropisetron(5-HT3受容体を抑える薬です。もともと吐き気を抑える薬として使われますが、本研究ではNAFLDの変化を軽くする方向の作用が示されました。)を飲み水に混ぜて4週間投与しました。

本研究は、肝臓から出る自律神経(意識しなくても働く神経で、内臓の働きやホルモン分泌などを調整します。臓器どうしの情報のやりとりにも関わる点が重要です。)の信号が、NAFLDやNASHの発症と進行に実際に関わっており、その流れの中で腸のserotonin(体内で働く物質の一つで、特に多くが腸で作られます。腸の動きや神経の働きに関わるだけでなく、本研究では肝臓の脂肪化や線維化に関わる可能性が示されました。)が重要な働き手になっている可能性を示しました。
神経の信号を遮断する方法と、serotonin受容体を抑える方法のどちらでも、肝臓の脂肪化と線維化(肝臓が傷ついた後の修復が進みすぎて、硬い組織が増える変化です。進むほど肝臓が働きにくくなり、病気の重症度を示します。)が改善し、腸のバリアに関わるタンパク質が増えました。また、腸内細菌の状態や短鎖脂肪酸(腸内細菌が食物繊維などから作る、酢酸や酪酸などの小さな脂肪酸です。腸の環境やバリア機能、体の代謝に関わるため重要です。)の変化とも関係していることが示されました。
効果は特に4週で強く、8週で弱まりやすかった点から、神経の信号が病気の開始だけでなく進行にも関わる可能性が支持されます。著者らは、腸のserotoninの信号を調整することが治療の候補になりうると述べていますが、現時点ではマウスでの結果に限られる点も示しています。

今後は、serotonin(体内で働く物質の一つで、特に多くが腸で作られます。腸の動きや神経の働きに関わるだけでなく、本研究では肝臓の脂肪化や線維化に関わる可能性が示されました。)がNASHの進行にどの程度関わるかをさらに詳しく調べ、炎症細胞の動きとの関係も評価する必要があるとされています。
また、腸のバリアが崩れることで血液中に入りうる細菌由来成分（例：lipopolysaccharidesやbacterial DNA）の測定、便だけでなく血液中の短鎖脂肪酸(腸内細菌が食物繊維などから作る、酢酸や酪酸などの小さな脂肪酸です。腸の環境やバリア機能、体の代謝に関わるため重要です。)の測定などを追加すると、serotoninの信号と腸バリアの関係がよりはっきりすると提案されています。
さらに、capasaicinによる神経遮断の効果が時間とともに弱まったため、より長期に安定して神経の信号を調節できる方法が必要だとも述べています。
tropisetron(5-HT3受容体を抑える薬です。もともと吐き気を抑える薬として使われますが、本研究ではNAFLDの変化を軽くする方向の作用が示されました。)はすでに別用途で使われている薬なので、人の組織などで確かめる研究の重要性が示されていますが、この結果だけで人への効果を断定するものではない、と注意されています。