ラット骨内から摘出された純チタン製インプラントの表面分析 : 第2報 : 吸着生体分子の表面テクスチャーによる影響

市販のcommercially pure titanium（cpTi；「Ti」）製のスクリュー型歯科インプラントは高い臨床成功率を示し、一般に、表面テクスチャーと本来の酸化チタン層の双方によって駆動されるosseointegration（骨結合）に起因すると考えられている。これまでのin vitro研究から、生理的流体からのcalcium phosphate（例：hydroxyapatite）沈着がTiのbiocompatibility（生体適合性）の中心であるという見方が広く期待されてきた。しかし著者らの先行するin vivo回収研究では、ラット骨内で7日間留置したサンドブラストTiインプラントに、そのようなcalcium phosphate層は認められず、Tiの性能をよりよく説明するには他の初期界面現象が必要であることが示唆された。そこで本論文は、biomolecular adsorption（生体分子の吸着）に焦点を当て、細胞は裸の金属と直接接触するのではなく、吸着した分子層（タンパク質やその他の高分子）を介してインプラントと相互作用することを強調する。臨床的には、ミクロン規模（およそ~10 μm）の粗さが骨の固定性の改善と関連づけられているが、初期の吸着過程におけるその役割は不明確である。本研究は、異なるTi表面テクスチャーが生体分子（特にproteoglycansおよびsilicon関連種）の吸着にどのように影響し、その吸着差が初期の骨形成とどう関係するかを、in vivoで明らかにすることを目的とした。

XPSは、回収したTi表面がCとN信号に支配される非常に薄い生体分子層で覆われていることを示し、これは（タンパク質やproteoglycansを含む）生体高分子の吸着と整合した。推定される吸着層厚は留置時間により異なり（7日より3時間の方が有意に厚い）、表面テクスチャーによる差はなく、おおむね3–5 nmの範囲に収まり、概ね単分子層（monolayer）被覆と解釈された。calciumとphosphorusは少量のみ検出され、Ca/P原子比は一貫して非常に低く（≈0.2–0.3；条件を通じて<0.4）、hydroxyapatite（1.7）などのcalcium phosphate化合物に期待される値を大きく下回った。したがって著者らは、in vivoで7日以内にTi上でcalcium phosphate化合物が形成されないことを示すデータだと解釈した。硫黄信号は2つのS 2p成分に分解され、163.5 eV（タンパク質中のcysteine硫黄に割り当て）と168 eV（sulfate基に割り当て、主にproteoglycansに由来すると帰属）であった。タンパク質関連硫黄（163.5 eV）はpolished面とgrooved面で同程度だった一方、sulfate関連硫黄（168 eV）はpolished面でgrooved面の約2倍であった。多点解析は、テクスチャーによりCa–sulfate関係が異なることを示唆した。すなわちpolished面ではCaとsulfateは中等度の負の相関を示し（Caが主としてsulfateに結合するというよりTiに吸着していると解釈）、grooved面では弱い正の相関を示した（Caの有意な割合がsulfate基と関連していると解釈）。siliconはgrooved面よりpolished面でより明瞭であり、depth profilingは吸着層の最外層付近にsilanolate型構造と整合するsiloxy種を示唆した。新生骨形成はgrooved面でのみ観察されたと報告され、著者らの吸着に基づく解釈と一致した。

本研究では、側面に規定された平坦な試験領域を持つ弾丸型のcpTiインプラント（直径1.1 mm、長さ3.5 mm）を用いた。表面テクスチャーは2種類を準備した。1つは鏡面polished面（silica slurry、平均粒径0.06 μm）、もう1つはダイヤモンド工具によるfly cuttingでV字溝（90°）を形成したmicrotexturedな「grooved」面で、中央部に深さ10 μmの溝を作製し、両端はpolishedのままとした。留置前に、全インプラントをacetone中で5分間超音波洗浄し、その後、汚染物除去および滅菌／スパッタ洗浄工程としてAr sputter etching（RF、100 W、5分）を行った。インプラントは、抗菌薬を投与せずに、8週齢の雄Wistarラットの大腿骨に作製したドリル孔（孔：直径1.15 mm、深さ3 mm）へ留置し、3時間または7日後に回収した。回収後、緩く結合した物質を除去するために超純水で4分間超音波洗浄し、その後乾燥して真空下で保管した。各テクスチャー条件につき3試料を解析した。表面化学と吸着はXPS（単色Al Kα、25 W；スポット100 μm；take-off angle 45°；サーベイ0–1000 eV；高分解能C 1s、O 1s、Ca 2p、P 2p；S 2pは100 Wの高出力モードでも測定）で評価した。吸着層厚は、Ti強度変化から、IMFP 3.16 nm（Ti 2p3/2；bovine plasma albuminに対して算出された値）を用いて推定し、grooved面については有効角度の差に伴う幾何学補正を行った。Ca/P比は高分解能ピーク面積から原子感度係数（Ca = 1.833、P = 0.486）を用いて算出し、S 2p成分はピーク分離（deconvolution）により定量した。siliconのdepth profilingにはAr sputter etching（0.5 kV、4 mm²、1分；SiO2に対して0.5 nm/minとして校正）を用いた。統計比較にはStudent’s t-test（p = 0.05）を用いた。多点データセットは散布図、Pearson相関係数、回帰直線で検討した。

著者らは、ラット大腿骨におけるin vivo条件下での7日間において、Tiの初期界面はcalcium phosphate化合物の析出ではなく、薄い生体分子層の吸着によって特徴づけられると結論づけた。一貫して低いCa/P比は、この条件においてcalcium phosphate沈着がTiの優れた生体適合性の原因ではないことを示す根拠として用いられた。代わりに、タンパク質およびproteoglycansの吸着が中心的であり、表面テクスチャーはタンパク質関連信号よりもproteoglycan関連のsulfate信号に大きく影響すると提案された。重要な機構的解釈として、proteoglycansは大きく硬く、高度に硫酸化された構造のため、polishedとmicrogroovedのTiで異なる相互作用を示すとされた。polished面では、sulfate基が金属内の「mirror charges」と強く相互作用し、Ca結合を制限すると提案される。一方grooved面では、いくつかのsulfate基が金属からより離れた位置にあると推定され、Caとの関連を可能にし、その結果proteoglycansがCaリザーバーとして機能しうるとされた。このリザーバー機能が粗面（grooved）での初期骨形成を支える一方、polished面のproteoglycansは同様には骨形成を促進せず、場合によっては阻害しうると論じられた。さらに本論文は実用的応用として、XPSにおけるS 2pの168 eV（sulfate／proteoglycans）と163.5 eV（cysteine／タンパク質）の比を用い、同等の化学条件下でこの比が小さいほど骨形成に有利な粗さを示す可能性があるとして、in vivoの短期（3時間）で粗さ関連の生体適合性を評価する提案を行った。

本研究は、Ti–組織界面におけるsiliconの生物学的役割は「さらなる研究が必要」と明示している。著者らはSiをgrooved面よりpolished面でより明瞭に検出し、その化学状態をsilanolate関連と解釈した（depth profilingで異なるsiloxyユニットを検出）が、これが骨形成にどう寄与するかの定義には踏み込まなかった。より広く言えば、提案された吸着機構は、proteoglycanの配置、金属表面での静電相互作用、Caの関連が、in vivo条件下でmicrotextureによりどのように変化するかを、今後さらに明確化すべきことを示唆する。著者らはまた、硫黄ピークに基づくXPS指標（168 eV / 163.5 eV）を迅速なin vivo評価ツール候補として提示しており、インプラントの化学特性、テクスチャー、生物学的状況をまたいだ頑健性の検証が、この提案の範囲内で暗に次の課題として位置づけられている。

市販の純チタン製の歯科インプラントは、治療がうまくいく確率が高いことで知られています。これは、インプラントの表面の凹凸や、表面に自然にできる酸化膜が関係して、骨としっかり結びつくからだと考えられてきました。
以前の実験室での研究では、体の液体の中からカルシウムとリンの化合物がチタン表面に沈着することが、生体にやさしい理由だと期待されていました。しかし、動物の体内から回収したインプラントを調べると、短期間ではそのような層が見つからないことが示されました。
そこでこの研究では、骨や細胞が金属に直接触れるのではなく、まずインプラント表面にタンパク質などの分子が薄く付着し、その層を通して体が反応する点に注目しました。特に、表面がなめらかな場合と、10マイクロメートル程度の溝がある場合で、生体分子（とくにプロテオグリカンやシリコンに関係する成分）の付き方がどう変わり、それが初期の骨形成とどう関係するかを、動物の体内で確かめることが目的です。

回収したチタン表面は、炭素や窒素の信号が強い、とても薄い生体分子の膜で覆われていました。これはタンパク質やプロテオグリカンなどが表面に付着した結果だと考えられます。膜の厚さはだいたい3から5ナノメートルで、表面の種類による差はほぼなく、分子が一層だけ並んだ程度の厚みだと解釈されました。また、3時間後のほうが7日後より膜がやや厚い傾向がありました。
カルシウムとリンは少しだけ検出されましたが、カルシウムとリンの比はとても低く、骨の主成分に近いリン酸カルシウムができているとは言いにくい値でした。つまり、少なくとも7日以内では、体内でチタン表面にリン酸カルシウムの層ができるわけではないと考えられました。
硫黄の信号を詳しく見ると、タンパク質由来と考えられる硫黄は、なめらかな面と溝のある面でほぼ同じでした。一方、プロテオグリカン由来と考えられる硫酸基の硫黄は、なめらかな面のほうが溝のある面より多い傾向がありました。さらに、カルシウムと硫酸基の関係は表面で異なり、溝のある面ではカルシウムが硫酸基と結びついている可能性が示されました。
シリコンは溝のある面より、なめらかな面で目立って検出され、表面近くに特定のシリコン化合物に近い形で存在する可能性が示されました。新しい骨ができたという観察は、溝のある面でのみ報告されました。

純チタンの弾丸型インプラントを作り、側面に平らな観察領域を用意しました。表面は2種類で、1つは鏡のようになめらかな面、もう1つは中央部に深さ約10マイクロメートルのV字溝を作った面です。
インプラントは洗浄と表面処理を行った後、8週齢の雄ラットの大腿骨に埋め込み、3時間後または7日後に回収しました。回収後は、弱く付いた汚れを落とすために超純水で洗浄し、乾燥させて保管しました。
表面に付着した物質の種類や量はXPS(表面にどんな元素や化学状態の物質があるかを調べる測定法です。インプラント表面に付いたごく薄い層を調べるのに適しています。)という分析法で調べ、付着膜の厚さ、カルシウムとリンの比、硫黄の状態の違いなどを評価しました。シリコンについては、表面から少しずつ削りながら深さ方向の変化も調べました。

この研究は、ラット骨内という体内環境では、チタン表面の初期状態は「リン酸カルシウムが積もること」よりも、「タンパク質やプロテオグリカンなどの生体分子が薄く付着すること」で特徴づけられると結論づけました。
表面の凹凸は、タンパク質よりも、プロテオグリカンに関係する成分の付き方や、カルシウムとの関わり方に影響する可能性が示されました。溝のある面では、プロテオグリカンがカルシウムをためるように働き、そのことが初期の骨形成を助けるかもしれない、という考え方が提案されています。
さらに応用として、XPS(表面にどんな元素や化学状態の物質があるかを調べる測定法です。インプラント表面に付いたごく薄い層を調べるのに適しています。)で見える硫黄の2種類の信号の比を使えば、短時間の体内試験（3時間）でも、骨形成に有利な表面粗さを見分けられる可能性があると示しました。

シリコンが体内でどんな役割を持ち、骨形成にどう関わるのかは、まだはっきりしていないため、追加の研究が必要だとされています。
また、表面の凹凸によって、プロテオグリカンがどのような形で表面に配置され、どの程度カルシウムと結びつくのかなど、体内で起きる細かい仕組みをさらに確かめる必要があります。提案された硫黄信号の比を使う評価方法についても、さまざまな条件で本当に使えるかどうかを検証することが今後の課題です。