USP10はドーパミンが誘導する活性酸素依存性の神経細胞死をNrf2活性化によって抑制する

活性酸素種（ROS）は、通常の細胞内シグナル伝達に寄与する一方で、過剰に産生されると病的な障害を引き起こす。酸化ストレスに対する神経細胞の脆弱性は、とくにドパミン作動性ニューロンが選択的に変性するパーキンソン病（PD）と関連して重要である。ドパミン自体がROS生成を促進し、ROS依存的なアポトーシスを神経細胞で誘導し得るため、ドパミン誘導性毒性は酸化ストレスに関連した神経細胞死の扱いやすいモデルとなる。抗酸化転写因子Nrf2は、HO-1やNQO1などの遺伝子を誘導して酸化損傷に対抗するが、Nrf2は阻害因子Keap1および活性化因子p62（SQSTM1）によって厳密に制御されている。この制御には、p62のセリン349におけるリン酸化（pp62-S349）や、ストレスによって生じるNrf2翻訳の変化などが含まれる。USP10はユビキチン特異的プロテアーゼであり、これまで非神経系の状況で抗酸化作用との関連が報告されている。本研究は、USP10がドパミン誘導性の酸化ストレスとアポトーシスから神経細胞を保護するかどうか、またUSP10がNrf2/Keap1/p62からなる抗酸化システムにどのような機序で影響するかを明らかにすることを目的とした。

ドパミン作動性様の特徴をもつ神経芽腫細胞株SH-SY5YにおいてUSP10を枯渇させると、ドパミンによる生存率低下が増大し、切断型caspase-3陽性などのアポトーシスマーカーが上昇した。USP10ノックダウン（USP10-KD）は、CM-H2DCFDAで測定したドパミン誘導性ROS蓄積も増強し、この増大した細胞毒性はN-acetylcysteineによって軽減されたことから、ROS依存的機序が支持された。さらにUSP10-KDはH2O2に対する感受性も高め、酸化ストレス因子一般に対して広く関連する可能性が示された。機序として、対照細胞ではドパミンによりNrf2タンパク質とNrf2誘導性遺伝子HO-1が増加したのに対し、これらの増加はUSP10-KDにより低下し、ドパミン曝露後のNrf2の核内蓄積もUSP10-KDで減少した。機能的摂動では、Nrf2-KDまたはp62-KDによりドパミン毒性が増大した。一方、Keap1-KDはUSP10-KDが引き起こすドパミン毒性の増強を部分的に逆転させ、Nrf2/HO-1レベルも回復させたことから、USP10の下流でKeap1依存的なNrf2抑制が位置づけられた。USP10-KDはNrf2 mRNAを低下させなかったが、ドパミンに伴う全体的翻訳（global translation）を抑制し、ストレス顆粒の形成を増加させた。これは、ドパミンストレス下でのNrf2翻訳低下と整合的である。USP10はp62と相互作用し、pp62-S349およびp62–Keap1相互作用を促進した。USP10-KDはpp62-S349を低下させ、p62–Keap1結合を弱め、p62-body形成も減少させた。リン酸化模倣体のp62-S349E（ただしp62-WTやp62-S349Aではない）を発現させると、Nrf2シグナルが増強し、ドパミン処理したUSP10-KD細胞で生存率が大きく改善しアポトーシスが低下した。ただし保護はUSP10-WTレベルまで完全には回復せず、p62リン酸化以外にもUSP10依存的な保護作用が存在することが示唆された。

本研究は主に、定義培地条件下で培養したSH-SY5Yヒト神経芽腫細胞を、ドパミン誘導性酸化傷害の神経モデルとして用いた。USP10、Nrf2、p62、Keap1はそれぞれsiRNAトランスフェクションにより個別に枯渇させ、ノックダウンはWestern blottingで確認した。酸化ストレス誘導のためにドパミン（0.1–0.4 mM）を所定の時間（例：4–12 h）適用し、追加の酸化剤チャレンジとしてH2O2も用いた。細胞生存率は細胞デヒドロゲナーゼ活性に基づくCCK-8アッセイで定量し、アポトーシスは切断型caspase-3の免疫染色で評価した。細胞内ROSはCM-H2DCFDAの蛍光顕微鏡観察で測定し、平均蛍光強度解析で定量した；ROS依存性はN-acetylcysteineで検討した。Nrf2経路活性は、Nrf2およびHO-1、NQO1などの標的についてWestern blottingで評価し、さらにNQO1、GSTM1、p62、Nrf2のmRNAをβ-actinで正規化したreal-time RT-PCRで測定した。核内と細胞質のNrf2分布は、分画（NE-PER）と免疫ブロットで解析した。翻訳の変化はpuromycin取り込みアッセイ（10 μg/mlを10 min）で調べ、ストレス顆粒はG3BP1とTIA1マーカーを用いた免疫蛍光により定量した。共免疫沈降によりUSP10–p62相互作用およびp62–Keap1結合を評価し、pp62-S349の検出も行った（オートファジーによるターンオーバーのためpp62-S349検出を補助する目的でbafilomycin A1を使用）。凝縮体形成（p62-bodies、p62/Keap1-bodies、p62/pp62-bodies）は、サイズ閾値を用いて蛍光顕微鏡で定量した。レトロウイルス発現系により、p62-WT、p62-S349E、p62-S349Aを過剰発現する安定なSH-SY5Y株を作製した。統計解析は一元配置ANOVAと適切な多重比較手順を用い、分散の仮定が満たされない場合はWelch/Brown–Forsytheに基づく手法を適用した。

本研究は、USP10が神経細胞においてドパミン誘導性の酸化傷害に対する保護的調節因子として働き、Nrf2依存的な抗酸化防御を高めることでROS依存的アポトーシスを低減すると結論づけた。強調される機序は2点である。(i) USP10はドパミンに伴う全体的翻訳を支え、Nrf2翻訳も含めて維持する一方、USP10枯渇は翻訳抑制を促進し、ストレス顆粒形成の増加を伴う。(ii) USP10はpp62-S349増加を介してp62活性化を促し、p62–Keap1相互作用を強めることで、Keap1によるNrf2阻害からの解放を促進し、Nrf2の核内蓄積と抗酸化遺伝子誘導を支える。遺伝学的エピスタシス実験によりこの経路の論理は補強されており、Keap1を減らすとUSP10枯渇で生じる脆弱性が相殺され、Nrf2またはp62の喪失はドパミン毒性増大を再現（phenocopy）した。USP10-KD細胞でp62-S349Eが示す部分的なレスキューは、USP10の神経保護作用がp62リン酸化だけでは完全に説明できないことを示し、翻訳関連の追加機序とも整合する。総合すると、本研究はUSP10を、神経の酸化ストレス応答におけるNrf2/Keap1/p62軸の重要な調節因子として位置づけ、細胞モデルの範囲にとどまりつつも、PDを含む酸化ストレス関連疾患に対してUSP10活性化が治療的に重要となり得ることを論じている。

著者らは、さらなる研究が必要な未解決問題をいくつか挙げている。第一に、USP10枯渇で全体的翻訳抑制とストレス顆粒増強がみられること、さらにリボソームタンパク質（RPS2、RPS3、RPS10）のユビキチン化変化がリボソーム機能不全を示す可能性があることを踏まえ、酸化ストレス下でUSP10がどのようにNrf2翻訳を制御するのかを明確にする必要がある。第二に、USP10がpp62-S349を増加させる機序は未解明であり、議論ではp62キナーゼの活性化やp62ホスファターゼの阻害といった可能性が提案されているが、どれが当てはまるかは結論づけられていない。第三に、USP10の抗酸化／抗アポトーシス機能と、Lewy小体に類似するα-synuclein/USP10/p62陽性凝集体との報告上の関連との関係が、PD病態理解の重要領域として示されており、疾患進展の中でこれらの活動がどのように交差するかが課題である。最後に、PDの文脈でUSP10が神経細胞のNrf2活性をどのように調節するかを検討する重要性が強調されている。具体的には、PDにおける黒質ニューロンでの核内Nrf2局在の既存観察や、扁桃体でのUSP10タンパク質レベルのわずかな上昇が参照される一方、これらの観察だけではNrf2活性化が十分かどうか、また患者においてUSP10がこの応答をどう調節するかはまだ確立していないことが指摘されている。

活性酸素種(細胞の中で生まれる反応性の高い酸素の仲間で、少量なら情報伝達に役立ちますが、多すぎるとタンパク質やDNAなどを傷つける原因になります)は、ふだんは細胞のはたらきを調整する役目もありますが、増えすぎると細胞を傷つけます。特に神経細胞は酸化ストレス(活性酸素種などによる攻撃と、それを打ち消す抗酸化の力のバランスが崩れ、細胞が傷つきやすくなる状態です)に弱く、ドパミンを使う神経細胞が減っていくパーキンソン病(主にドパミン作動性ニューロンが失われることで、ふるえや動きにくさなどが起こる神経の病気です)とも深く関係しています。ドパミンは神経の情報伝達に必要な物質ですが、同時に活性酸素種を増やして細胞死を起こすことがあります。
体には酸化ストレスから守る仕組みがあり、その中心の1つがNrf2(酸化ストレスがかかったときに、抗酸化に関わる遺伝子のスイッチを入れて細胞を守る転写因子です)という因子です。Nrf2は抗酸化に関わる遺伝子を働かせますが、Keap1(ふだんNrf2を抑えて分解されやすくする役割を持ち、Nrf2が働きすぎないように調整する因子です)やp62(細胞内の不要物処理などに関わるタンパク質で、条件によってはKeap1をつかまえてNrf2の働きを助けます)というタンパク質により細かく調整されています。
この研究では、USP10(ユビキチン化という目印を外す酵素の1つで、この研究ではNrf2の働きを高めて神経細胞を酸化ストレスから守る役割が示されました)という酵素が、ドパミンによる酸化ストレスや細胞死から神経細胞を守るのか、そしてUSP10がNrf2と関係する抗酸化の仕組みにどう影響するのかを調べました。

ドパミンに似た性質をもつ細胞株SH-SY5Y(ヒトの神経芽腫由来の細胞株で、ドパミン神経に似た性質があり神経の研究でよく使われます)でUSP10(ユビキチン化という目印を外す酵素の1つで、この研究ではNrf2の働きを高めて神経細胞を酸化ストレスから守る役割が示されました)を減らすと、ドパミンによる細胞の生存率低下が強まり、細胞死の目印も増えました。同時に、細胞内の活性酸素種(細胞の中で生まれる反応性の高い酸素の仲間で、少量なら情報伝達に役立ちますが、多すぎるとタンパク質やDNAなどを傷つける原因になります)もより多くたまりました。この毒性は抗酸化物質のN-acetylcysteine(体内で抗酸化物質を作る材料になり、活性酸素種によるダメージを減らす目的で実験でも使われます)で弱まったため、活性酸素種が原因の細胞死だと考えられました。また、過酸化水素(細胞内でも生じる活性酸素種の一種で、酸化ストレスの代表的な要因として実験でよく使われます)に対しても弱くなり、USP10が酸化ストレス(活性酸素種などによる攻撃と、それを打ち消す抗酸化の力のバランスが崩れ、細胞が傷つきやすくなる状態です)全体への耐性に関わる可能性が示されました。
しくみを調べると、通常はドパミンによってNrf2(酸化ストレスがかかったときに、抗酸化に関わる遺伝子のスイッチを入れて細胞を守る転写因子です)や、その働きで増えるHO-1(Nrf2によって増える抗酸化に関わる遺伝子産物の1つで、酸化ストレスから細胞を守る側に働きます)が増えますが、USP10を減らすとその増加が小さくなり、Nrf2が核へ移動してたまる量も減りました。さらに、Nrf2やp62(細胞内の不要物処理などに関わるタンパク質で、条件によってはKeap1をつかまえてNrf2の働きを助けます)を減らしてもドパミン毒性は強まりました。一方でKeap1(ふだんNrf2を抑えて分解されやすくする役割を持ち、Nrf2が働きすぎないように調整する因子です)を減らすと、USP10を減らして起きた毒性の強まりが一部打ち消され、Nrf2やHO-1も回復しました。
また、USP10を減らしてもNrf2のmRNAは減らなかったのに、ドパミンのストレス下で細胞全体のタンパク質合成が弱まり、ストレス顆粒(強いストレス時に細胞質にできる粒状の集まりで、翻訳を止められたmRNAなどが集まることで細胞を守る面があります)が増えました。これはNrf2のタンパク質が作られにくくなることと合っています。
さらにUSP10はp62と結びつき、p62の特定部位のリン酸化(タンパク質にリン酸が付く化学変化で、タンパク質の働きが強まったり弱まったりする調節方法の1つです)を増やし、p62とKeap1の結合を強める方向に働きました。USP10を減らすと、このリン酸化やp62とKeap1の結びつき、p62のかたまりの形成が弱まりました。リン酸化した状態をまねるp62変異体を入れると、Nrf2の働きが強まり、USP10を減らした細胞でも生存率が大きく改善しました。ただし完全には元に戻らず、USP10には別の守り方もあると考えられました。

ヒト由来の神経芽腫細胞SH-SY5Y(ヒトの神経芽腫由来の細胞株で、ドパミン神経に似た性質があり神経の研究でよく使われます)を培養し、ドパミンで酸化ストレス(活性酸素種などによる攻撃と、それを打ち消す抗酸化の力のバランスが崩れ、細胞が傷つきやすくなる状態です)を起こすモデルとして使いました。USP10(ユビキチン化という目印を外す酵素の1つで、この研究ではNrf2の働きを高めて神経細胞を酸化ストレスから守る役割が示されました)、Nrf2(酸化ストレスがかかったときに、抗酸化に関わる遺伝子のスイッチを入れて細胞を守る転写因子です)、p62(細胞内の不要物処理などに関わるタンパク質で、条件によってはKeap1をつかまえてNrf2の働きを助けます)、Keap1(ふだんNrf2を抑えて分解されやすくする役割を持ち、Nrf2が働きすぎないように調整する因子です)はsiRNA(特定の遺伝子のmRNAをねらって減らし、その遺伝子の働きを弱めるために使う短いRNAです)でそれぞれ減らし、タンパク質量の変化を確認しました。ドパミンや過酸化水素(細胞内でも生じる活性酸素種の一種で、酸化ストレスの代表的な要因として実験でよく使われます)でストレスを与え、細胞の生存率、細胞死の目印、活性酸素種(細胞の中で生まれる反応性の高い酸素の仲間で、少量なら情報伝達に役立ちますが、多すぎるとタンパク質やDNAなどを傷つける原因になります)の量を測定しました。
Nrf2経路の活性は、Nrf2やその標的遺伝子産物の量、mRNA量、核と細胞質での分布などで評価しました。タンパク質合成の強さは新しく作られたタンパク質の検出で調べ、ストレス顆粒(強いストレス時に細胞質にできる粒状の集まりで、翻訳を止められたmRNAなどが集まることで細胞を守る面があります)は特定のマーカーを使った染色で数えました。さらに、USP10とp62の結合、p62とKeap1の結合、p62のリン酸化(タンパク質にリン酸が付く化学変化で、タンパク質の働きが強まったり弱まったりする調節方法の1つです)状態なども解析しました。

USP10(ユビキチン化という目印を外す酵素の1つで、この研究ではNrf2の働きを高めて神経細胞を酸化ストレスから守る役割が示されました)は、ドパミンによる酸化ストレス(活性酸素種などによる攻撃と、それを打ち消す抗酸化の力のバランスが崩れ、細胞が傷つきやすくなる状態です)が原因の活性酸素種(細胞の中で生まれる反応性の高い酸素の仲間で、少量なら情報伝達に役立ちますが、多すぎるとタンパク質やDNAなどを傷つける原因になります)の増加と細胞死を抑え、神経細胞を守る因子だと結論づけられました。重要な点は2つあります。
1つ目は、ドパミンのストレス下でタンパク質合成が落ちすぎないように支え、Nrf2(酸化ストレスがかかったときに、抗酸化に関わる遺伝子のスイッチを入れて細胞を守る転写因子です)のタンパク質が作られるのを助けることです。2つ目は、p62(細胞内の不要物処理などに関わるタンパク質で、条件によってはKeap1をつかまえてNrf2の働きを助けます)を活性化してKeap1(ふだんNrf2を抑えて分解されやすくする役割を持ち、Nrf2が働きすぎないように調整する因子です)のNrf2抑制を弱め、Nrf2が核で働いて抗酸化遺伝子を増やせるようにすることです。
この結果は、酸化ストレスが関わる病気、特にパーキンソン病(主にドパミン作動性ニューロンが失われることで、ふるえや動きにくさなどが起こる神経の病気です)のような神経の病気で、USP10を活性化することが治療の考え方になり得ることを示しています。ただし、この研究は主に細胞モデルでの結果です。

今後の課題として、まずUSP10(ユビキチン化という目印を外す酵素の1つで、この研究ではNrf2の働きを高めて神経細胞を酸化ストレスから守る役割が示されました)が酸化ストレス(活性酸素種などによる攻撃と、それを打ち消す抗酸化の力のバランスが崩れ、細胞が傷つきやすくなる状態です)下でNrf2(酸化ストレスがかかったときに、抗酸化に関わる遺伝子のスイッチを入れて細胞を守る転写因子です)のタンパク質合成をどう支えているのかを詳しく調べる必要があります。特に、USP10を減らすとリボソーム(mRNAからタンパク質を作るための装置で、翻訳の中心になる構造です)関連タンパク質のユビキチン化(タンパク質にユビキチンという目印を付ける仕組みで、分解や機能調節の合図として使われます)が変わる点から、タンパク質合成装置の不調との関係が注目されます。
次に、USP10がp62(細胞内の不要物処理などに関わるタンパク質で、条件によってはKeap1をつかまえてNrf2の働きを助けます)のリン酸化(タンパク質にリン酸が付く化学変化で、タンパク質の働きが強まったり弱まったりする調節方法の1つです)を増やす具体的な仕組みは未解明で、リン酸化を進める酵素の活性化や、リン酸化を外す酵素の抑制などの可能性が残っています。
さらに、パーキンソン病(主にドパミン作動性ニューロンが失われることで、ふるえや動きにくさなどが起こる神経の病気です)で見られるLewy小体(パーキンソン病の脳で見られる特徴的なタンパク質のかたまりで、α-synucleinなどが集まってできます)に似た凝集体と、USP10の抗酸化作用が病気の進行の中でどう結びつくのかも重要です。最後に、患者の脳でUSP10がNrf2の働きをどの程度調整できているのか、現実の病態に即した検証が求められます。