筋萎縮性側索硬化症に関連するp62/SQSTM1変異体が形成する相分離液滴は内部流動性が低下している

液−液相分離（liquid–liquid phase separation）は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）関連タンパク質のいくつかに共通する性質として注目されており、疾患関連変異はしばしば、動的な液滴（droplets）からより固体に近い状態や凝集へと偏る変化と相関する。SQSTM1/p62は、オートファジー（autophagy）のアダプターおよびシグナル伝達の足場タンパク質であり、LC3-interacting region（LIR）やKEAP1-interacting region（KIR）など複数のドメインをもつ。p62がユビキチン化基質と結合すると、相分離したボディへと凝縮し、選択的オートファジー（LC3のリクルートと上流のオートファジー因子を介する）を支えると同時に、Keap1–Nrf2経路（KEAP1の隔離によりNRF2の核内蓄積と標的遺伝子誘導を可能にする）を通じて抗酸化ストレス応答を活性化する。SQSTM1/p62のミスセンス変異はALS、前頭側頭変性症（FTD）、骨Paget病と関連するが、ALS/FTD関連のLIR/KIR変異が主として、液滴形成そのものを破綻させるのか、オートファジーを損なうのか、NRF2シグナル伝達を損なうのか、あるいは両者に影響するのかは不明確であった。そこで本研究は、疾患関連のLIR/KIRミスセンス変異が、(i) 細胞および生化学的条件下でのLC3およびKEAP1との相互作用、(ii) p62によるNRF2活性化、(iii) p62のオートファジーによるターンオーバー、(iv) p62コンデンセート（condensates）の物理的性質、とくに内部流動性（inner fluidity）にどのように影響するかを評価することを目的とした。

LIRとKIRの間に位置する複数のALS/FTD関連ミスセンス変異体を横断して、著者らは、オートファジー関連ターンオーバーとNRF2シグナル伝達への影響は多様（heterogeneous）である一方、コンデンセートの材料特性（material properties）には共通した欠陥があることを見いだした。相互作用アッセイでは、一部の変異がKEAP1および／またはLC3への結合を変化させるが、その影響は実験条件に依存することが示された。界面活性剤（detergent）を含む溶解液での免疫沈降では、多くの変異体がKEAP1結合を保持していることが示唆された（ただしp62S349T、p62G351A、ならびにKEAP1結合不全の対照であるp62T350Aなどは例外）。一方、生細胞でのNanoBRET法では、p62P348LでKEAP1相互作用の低下が、p62L341VでLC3B相互作用の低下が検出された（また、LIR不全の対照p62W338A L341AでもLC3B相互作用の低下がみられた）。機能的には、初代マウス肝細胞において、p62P348Lとp62G351A（p62T350Aと同様）はNRF2の核内蓄積が著しく低下し、NRF2標的遺伝子（GSTM1、UGDH、NQO1を含む）の誘導も低下したが、他の評価した疾患関連変異体はこの条件下で同様の異常を示さなかった。doxycycline誘導型のターンオーバーアッセイでは、p62W338A L341Aとp62D336Nがオートファジー依存的分解に抵抗性を示し（bafilomycin A1への反応も小さい）、それ以外の多くの疾患変異体（p62L341Vを含む）は野生型p62と同程度に分解された。重要な点として、すべての変異体は動きや融合を伴う液体様の液滴を形成したが、FRAPではすべての変異体液滴で内部流動性の低下が認められ、野生型液滴に比べてmobile fractionが一貫して低かった（回復半減期の遅延はp62P348Lで特に示された）。変異体液滴は概して野生型より小さく、p62S349Tとp62G351Aでは液滴数が少なく、これら2変異体では液滴形成効率がやや低い可能性が示唆された。

著者らは、構造モデリング、生化学的相互作用アッセイ、生細胞での相互作用測定、NRF2活性化の機能的指標、オートファジーによるターンオーバーアッセイ、コンデンセート特性の定量イメージングを組み合わせた。LIR–LC3複合体（PDB 2ZJD）およびKIR–KEAP1複合体（PDB 3ADE）の既知構造を用い、特定の置換（例：D336N、D337E、L341V、P348L、S349T、T350A、G351A）が静電的接触、立体的適合性、または分子内水素結合をどのように変えるかを予測し、結合への影響を推定した。CRISPR/Cas9によりp62欠損HEK293T細胞を作製し、FLAGタグ付き野生型または変異型p62を発現させ、抗FLAG免疫沈降とイムノブロットによりタンパク質量および相手因子（KEAP1およびLC3Bの各フォーム）との結合を評価した。界面活性剤による溶解は液滴関連の相互作用を破壊しうるため、生細胞のp62欠損HEK293T細胞でNanoBRETアッセイも実施し、p62をHaloTagに融合し、KEAP1、LC3B、またはFIP200をNanoLucルシフェラーゼに融合して、細胞内相互作用を定量した。生理学的に関連の高い文脈で高感度にNRF2経路を検証するため、組換えアデノウイルス（MOI 100）で野生型または変異型のヒトp62を初代マウス肝細胞へ導入し、その後、分画／イムノブロットで核内NRF2タンパク質を測定し、TaqMan qRT-PCRによりNRF2標的転写産物（GSTM1、UGDH、NQO1；Gusbで正規化）を定量した。p62のオートファジー性ターンオーバーを測定するため、p62ノックアウトHuh-1細胞を作製し、FLAGタグ付きp62バリアントを発現するtet-ONのdoxycycline誘導系を導入した。誘導後にdoxycyclineを除去して時間経過でタンパク質減衰を追跡し、bafilomycin A1を用いてオートファジー依存的蓄積を検討した。コンデンセート形態は共焦点イメージングと、真円度（circularity）、液滴サイズ、液滴数（直径範囲で液滴を定義）の定量解析により評価し、さらにタイムラプスで液滴融合を観察した。最後に、内部ダイナミクスは、一定サイズのGFPタグ付きp62液滴に対するFRAPにより定量し、反復測定から回復半減期（t50）とmobile fractionを抽出した。

本研究は、p62のLIR/KIR領域にあるALS/FTD関連ミスセンス変異が、選択的オートファジーまたはNRF2シグナル伝達におけるp62の標準的（canonical）機能を一様に失わせるわけではないと結論づける。すなわち、NRF2活性化の欠陥が測定可能だったのは一部の変異体（初代肝細胞でのp62P348Lおよびp62G351Aが顕著）に限られ、オートファジー依存的p62ターンオーバーの欠陥が目立ったのも一部（p62D336NおよびLIR破綻の対照p62W338A L341Aが顕著）であった。これに対し、調べた疾患関連変異体すべてに共通して一貫した表現型は、p62コンデンセート状態の質的変化であった。すなわち、変異タンパク質は細胞内で液体の液滴様構造を形成し続けるが、FRAPのmobile fraction低下が示すように液滴内部の流動性が低下していた。著者らは、この流動性低下という収束した変化を、他のALS/FTD関連の相分離タンパク質での観察（疾患変異が液滴をより固体様状態へ偏らせ、凝集に先行しうる）と並行する潜在的な一次欠陥と解釈する。短期アッセイでは一部の変異体でのみ機能障害が検出されるとしても、コンデンセートの材料特性の変化は、より長い時間スケールでは下流の機能不全（オートファジーでの認識／処理障害や、KEAP1隔離の異常など）に寄与しうる、と彼らは主張する。本研究の意義は、「液滴形成の消失」やLC3/KEAP1結合の一様な破綻という単純なモデルから、疾患変異がコンデンセート動態（流動性低下）の共通した変化を引き起こすというモデルへ重点を移し、多様なp62変異をALS/FTD病態に関連する共通の生物物理学的機構で統一し得る点にある。

著者らは、変異p62液滴の内部流動性低下は、より固体に近い状態へ移行しやすい傾向を反映している可能性があり、それが後の凝集を促進し、オートファジーやNRF2機能の即時かつ一様な喪失ではなく、長期にわたる質的変化を通じて病理に寄与し得ると提案する。液滴内で形成される多価の高分子ネットワークの組み立ての変化（ユビキチン化基質、NBR1のようなクライアントタンパク質、オートファジー因子、RNAを含みうる；小型non-coding RNAがp62凝縮を制御し得るという既報にも言及）が流動性低下の背景にあり、変異がこれらの会合バランスを乱す可能性があるという。さらに、ALS/FTD関連のSQSTM1/p62ミスセンス変異は遺伝子全体に分布し、相分離に必要な領域（例：intrinsically disordered segmentsやUBAドメイン）にも及ぶことから、異常なコンデンセート特性を中心とするより広い疾患機構と整合的であることを強調する。本論文は長期的実験やin vivoでの病勢進行実験は提示しないが、今後は、液滴流動性の慢性的低下が時間とともに凝集形成、KEAP1隔離挙動、選択的オートファジー効率にどのように影響するかを評価することが、p62変異がALS/FTD表現型へとつながる過程を理解するうえで重要だという方向性を示している。

液液相分離(細胞内でタンパク質などが周りの液体から分かれて集まり、液体のしずくのような構造を作る現象です。物質の反応の場を作ったり、必要な分子を集めたりするのに役立ちます。)とは、細胞の中でタンパク質などが集まって、油のしずくのような液体のかたまりを作る現象です。ALS(運動神経が障害され、筋肉がやせて力が入りにくくなる進行性の病気です。タンパク質の異常な集まりが関係すると考えられています。)に関係するタンパク質では、この「液体のしずく」が変異によって、だんだん固まりやすくなったり、集まってかたまり（凝集(タンパク質が集まって固まり、塊のようになることです。神経変性疾患では細胞に悪影響を与えることがあります。)）になったりすることが病気と関係すると考えられています。
p62(細胞内の不要物に目印を見つけて集まり、オートファジーで分解するのを助ける「アダプター」役のタンパク質です。しずく構造を作り、分解やストレス応答の調整にも関わります。)は、細胞内のいらないものを分解する仕組みであるオートファジー(細胞が自分の中の不要なタンパク質や壊れた部品を回収して分解する仕組みです。細胞の掃除とリサイクルに重要です。)を助けるタンパク質で、LC3(オートファジーでできる膜構造に存在し、標的を取り込む過程で重要なタンパク質です。p62はLC3と結びついて分解へつなげます。)と結びつく部分（LIR(p62がLC3と結びつくための短い領域です。オートファジーの装置に標的を引き渡すのに重要です。)）や、KEAP1(通常はNRF2の働きを抑える役割を持つタンパク質です。p62に捕まるとNRF2が働きやすくなります。)と結びつく部分（KIR(p62がKEAP1と結びつくための領域です。KEAP1を閉じ込めてNRF2を働かせるのに関係します。)）などを持っています。p62は、ユビキチン(不要になったタンパク質などに付けられる小さな目印のタンパク質です。分解や輸送の合図として働きます。)が付いた不要物と結びつくと、しずく状の構造に集まり、オートファジーを進めます。同時に、KEAP1をしずくの中に閉じ込めることで、NRF2(酸化ストレスから細胞を守る遺伝子のスイッチを入れる転写因子です。防御反応を動かす中心的な役割があります。)という因子が働きやすくなり、酸化ストレス(活性酸素などによって細胞が傷つきやすくなる状態です。防御が弱いと細胞障害が進みます。)から細胞を守る反応も強めます。
しかし、ALSやFTD(前頭葉や側頭葉が障害され、性格変化や言語障害などが起こる神経変性疾患です。ALSと同じ原因が一部重なることがあります。)に関係するp62のLIRやKIR付近の変異が、しずくを作れなくするのか、オートファジーを弱めるのか、NRF2の働きを弱めるのか、またはその両方に影響するのかは、はっきりしていませんでした。そこで本研究では、病気に関係するp62の変異が、LC3やKEAP1との結びつき、NRF2の活性化、p62自身の分解されやすさ、そしてしずくの性質（特にしずく内部の流れやすさ）にどう影響するかを調べました。

複数のALS(運動神経が障害され、筋肉がやせて力が入りにくくなる進行性の病気です。タンパク質の異常な集まりが関係すると考えられています。)やFTD(前頭葉や側頭葉が障害され、性格変化や言語障害などが起こる神経変性疾患です。ALSと同じ原因が一部重なることがあります。)に関係するp62(細胞内の不要物に目印を見つけて集まり、オートファジーで分解するのを助ける「アダプター」役のタンパク質です。しずく構造を作り、分解やストレス応答の調整にも関わります。)の変異をまとめて調べると、オートファジー(細胞が自分の中の不要なタンパク質や壊れた部品を回収して分解する仕組みです。細胞の掃除とリサイクルに重要です。)による分解のされ方やNRF2(酸化ストレスから細胞を守る遺伝子のスイッチを入れる転写因子です。防御反応を動かす中心的な役割があります。)の働きへの影響は、変異によってバラバラでした。一方で、しずくの性質には共通した問題が見つかりました。
タンパク質同士の結びつきを調べる実験では、変異によってLC3(オートファジーでできる膜構造に存在し、標的を取り込む過程で重要なタンパク質です。p62はLC3と結びついて分解へつなげます。)やKEAP1(通常はNRF2の働きを抑える役割を持つタンパク質です。p62に捕まるとNRF2が働きやすくなります。)への結合が変化する場合がありましたが、その結果は実験条件によって違うこともありました。生きた細胞の中で測る方法では、ある変異ではKEAP1との結びつきが弱くなったり、別の変異ではLC3との結びつきが弱くなったりすることが確認されました。
機能面では、マウスの肝細胞を使った実験で、一部の変異（例としてP348LやG351A）ではNRF2が核にたまりにくくなり、NRF2が働いて増えるはずの遺伝子の反応も弱まりました。しかし他の変異では、同じ条件で目立った異常が出ないものもありました。
また、p62がオートファジーで分解される速さを調べると、一部の変異では分解されにくくなる一方、多くの変異は正常型と同じくらい分解されました。
重要なのは、調べたすべての変異で、p62は液体のしずくを作ること自体はできていた点です。ただし、FRAP(蛍光で光る分子の一部を強い光で消してから、どれくらい早く光が戻るかで分子の動きやすさを調べる方法です。しずく内部の流動性評価に使われます。)という測定では、どの変異のしずくでも「しずくの中で分子が動き回る性質」が弱くなっていました。つまり、しずくの内部が、正常型よりもねばついて動きにくい状態になっていたと考えられます。さらに、変異のしずくは全体的に小さめで、特定の変異ではしずくの数が少ない傾向も見られました。

まず、p62(細胞内の不要物に目印を見つけて集まり、オートファジーで分解するのを助ける「アダプター」役のタンパク質です。しずく構造を作り、分解やストレス応答の調整にも関わります。)がLC3(オートファジーでできる膜構造に存在し、標的を取り込む過程で重要なタンパク質です。p62はLC3と結びついて分解へつなげます。)やKEAP1(通常はNRF2の働きを抑える役割を持つタンパク質です。p62に捕まるとNRF2が働きやすくなります。)とどう結びつくかについて、既知の立体構造データを使ったモデル計算で、変異が結合のしやすさにどう影響しそうかを予測しました。
次に、p62を欠損させた細胞を作り、そこへ正常型または変異型p62を入れて、免疫沈降(抗体を使って特定のタンパク質を取り出し、一緒に結びついている相手タンパク質を調べる実験法です。)などの方法でLC3やKEAP1との結びつきを調べました。
ただし、細胞を溶かすときに使う界面活性剤(細胞膜やタンパク質の集まりを溶かしやすくする薬剤です。しずく構造のような弱い集まりを壊すことがあります。)は、しずく構造に関係する結びつきを壊す可能性があります。そこで、生きた細胞内での結びつきを測れるNanoBRET(生きた細胞の中で、2つのタンパク質が近くにあるかを光のエネルギー移動で測る方法です。細胞内での相互作用を定量できます。)も使い、細胞内での相互作用を定量しました。
さらに、初代培養のマウス肝細胞にp62を導入し、NRF2(酸化ストレスから細胞を守る遺伝子のスイッチを入れる転写因子です。防御反応を動かす中心的な役割があります。)が核内にどれくらいたまるか、またNRF2が働いて増える遺伝子の量がどう変わるかを測定しました。
p62自身がオートファジー(細胞が自分の中の不要なタンパク質や壊れた部品を回収して分解する仕組みです。細胞の掃除とリサイクルに重要です。)で分解されるかどうかは、発現を薬でオンオフできる仕組みを使い、時間経過でp62の減り方を追跡して評価しました。
しずくの形や大きさ、数、融合の様子は顕微鏡画像で定量し、しずく内部の動きやすさはFRAP(蛍光で光る分子の一部を強い光で消してから、どれくらい早く光が戻るかで分子の動きやすさを調べる方法です。しずく内部の流動性評価に使われます。)で、回復の速さや動ける割合を指標にして調べました。

本研究の結論は、ALS(運動神経が障害され、筋肉がやせて力が入りにくくなる進行性の病気です。タンパク質の異常な集まりが関係すると考えられています。)やFTD(前頭葉や側頭葉が障害され、性格変化や言語障害などが起こる神経変性疾患です。ALSと同じ原因が一部重なることがあります。)に関係するp62(細胞内の不要物に目印を見つけて集まり、オートファジーで分解するのを助ける「アダプター」役のタンパク質です。しずく構造を作り、分解やストレス応答の調整にも関わります。)のLIR(p62がLC3と結びつくための短い領域です。オートファジーの装置に標的を引き渡すのに重要です。)やKIR(p62がKEAP1と結びつくための領域です。KEAP1を閉じ込めてNRF2を働かせるのに関係します。)付近の変異が、オートファジー(細胞が自分の中の不要なタンパク質や壊れた部品を回収して分解する仕組みです。細胞の掃除とリサイクルに重要です。)やNRF2(酸化ストレスから細胞を守る遺伝子のスイッチを入れる転写因子です。防御反応を動かす中心的な役割があります。)の働きを一様に壊すわけではない、ということです。NRF2の異常がはっきり出る変異もあれば、オートファジーで分解されにくくなる変異もあり、影響は変異ごとに違いました。
一方で、調べた変異すべてに共通していたのは、p62のしずくが「作れるのに、中が動きにくい」という性質の変化でした。これは、しずくが将来的により固体に近づき、凝集(タンパク質が集まって固まり、塊のようになることです。神経変性疾患では細胞に悪影響を与えることがあります。)へ進みやすい方向への変化の可能性があります。
つまり、「しずくができなくなる」ことが共通原因なのではなく、「しずくの中身の性質が変わる（流動性が下がる）」ことが共通の重要な変化であり、長い時間ではオートファジーやNRF2の異常につながりうる、という考え方を強めた点に意義があります。

変異p62(細胞内の不要物に目印を見つけて集まり、オートファジーで分解するのを助ける「アダプター」役のタンパク質です。しずく構造を作り、分解やストレス応答の調整にも関わります。)のしずくで見られた内部流動性(しずくの中で分子がどれくらい自由に動けるかという性質です。低いほど中身が固まり気味で、反応や交換が起こりにくくなる可能性があります。)の低下は、時間がたつと凝集(タンパク質が集まって固まり、塊のようになることです。神経変性疾患では細胞に悪影響を与えることがあります。)が進みやすくなるサインかもしれません。その結果として、すぐには目立たない場合でも、長期的にはオートファジー(細胞が自分の中の不要なタンパク質や壊れた部品を回収して分解する仕組みです。細胞の掃除とリサイクルに重要です。)での処理のされ方や、KEAP1(通常はNRF2の働きを抑える役割を持つタンパク質です。p62に捕まるとNRF2が働きやすくなります。)の閉じ込め方、NRF2(酸化ストレスから細胞を守る遺伝子のスイッチを入れる転写因子です。防御反応を動かす中心的な役割があります。)の働き方が乱れる可能性があります。
今後は、しずくの中でどんな分子同士のつながりが変わっているのか、また流動性の低下が実際に凝集形成や細胞機能の低下へどうつながるのかを、より長期間の実験や生体内の実験で確かめることが重要だと示されています。