キュウリの果実内のIAA濃度と極性移動

インドール酢酸（indole-acetic acid：IAA）は、主に分裂組織やその他の若い組織で合成される植物ホルモンであり、茎の伸長や器官分化に強く影響する。IAAの特徴の一つは、茎頂からの極性輸送である。先行研究では、IAAの受容には細胞膜（plasma membrane）に結合した受容体が関与し、その結合部位は細胞外のアポプラスト（apoplast：AP）側に向いている可能性も示唆されている。カボチャの胚軸では、IAA濃度がシンプラスト（symplast：SY）よりもAP（外側の細胞膜流体）で数倍高いと報告されており、APに局在するIAAが発生制御に直接関与する可能性が示されている。しかし、IAA研究は主として実生や栄養器官に焦点が当てられてきた一方、著者らによれば果実を対象とした報告はなかった。こうした背景のもと、本研究はキュウリ果実を用いて、(i) 果実内の異なる部位・組織におけるAP溶液とSY溶液の内生IAA濃度を比較し、(ii) キュウリ果実組織に極性IAA輸送がみられるかを検証した。

胎座（placenta）では、採取したすべての位置（基部・中央部・先端部）において内生IAA濃度が一貫してSY溶液よりAP溶液で高かった（基部で15倍、中央部で6.5倍、先端部で5.3倍）。果肉（pulp）でも同様に、すべての位置でAPがSYを上回った（基部で5.4倍、中央部で7.9倍、先端部で3.9倍）。総合すると、キュウリ果実のIAA濃度はAPがSYの約4～15倍であり、カボチャ胚軸での先行観察と類似すると著者らはまとめている。SYでは胎座と果皮（pericarp）間でIAA濃度が同程度であり、著者らはこれを、単為結果性のキュウリ果実ではIAAが特定部位に限定されず果実全体で合成されていることを示唆するものと解釈している。放射標識IAAを用いた輸送試験では、果皮は3つの果実領域すべてで茎側へのIAA移動傾向が一貫していたのに対し、胎座では中央部と先端部で花側への移動がみられた。胎座の結果が一様に極性を示さなかったため、著者らは、胎座では極性輸送が弱いかほぼ存在せず、移動の多くは拡散で説明される可能性が高い一方、果皮では中程度の茎側極性があると推論している。

2つの実験を行った。実験Aでは、ハウス栽培のキュウリ（台木‘Super Yunryu’、穂木‘Hikarisokusei’）を採取し（24果、長さ約20 cm）、氷上で冷却後、縦方向に「基部」「中央部」「先端部」に分割し、基部2 cmと先端部2 cmは除去した。果肉と胎座から遠心分離によりAP溶液とSY溶液を別々に回収した。予備試験で、1 cmを超える切片は遠心中に破裂してSY流体が漏出することが示されたため、1 cm切片を用いた。コルクボーラーで組織円柱を作製し（果肉と胎座を分離）、プラスチックメッシュ上に置き、4°Cで4500 g・5分間の遠心によりAP溶液を回収した。次に同じ切片を液体窒素で凍結し、解凍後、同条件で再遠心してSY溶液を回収した。抽出液は-40°Cで保存した。SY試料には内部標準として200 pmolの13C6-IAAを添加し、精製にはアスコルビン酸とPVPを使用し、溶液をpH 2.8に調整後、ろ過（0.22 μm）し、ジエチルエーテルで抽出し、さらにHPLC（Inertsil ODS-3、続いてInertsil Ph-3）で精製した。AP試料では、2段階目のHPLC精製（Inertsil Ph-3）を省略した。IAAの定量は、APCIを用いたLC-MSの負イオンSIMモードで行い、IAAおよび13C-IAAのイオン（m/z 174/180；フラグメントイオン144/150）を、所定のスキャン設定下でモニターした。実験Bでは、[2-14C]IAAを希釈し（放射性トレーサー2 μlを水3 mlに）、果実中央部から基部・中央部・先端部の領域をそれぞれ2.5 cmで切り出し、果皮と胎座を分離して半割した。生重量測定後、放射性トレーサーの向きを基部（茎側）または先端（花側）方向に設定し、25°C・暗条件で7時間浸漬した。その後、非浸漬側から0.5 cmの切片を切り出し、放射能をACSIIシンチラントへ4日間溶出させ（毎日攪拌）、液体シンチレーション計数によりdpm（disintegrations per minute）を測定した。バックグラウンドを差し引き、断面積と時間で正規化（dpm/cm2/h）し、pmol = 0.011 dpmで換算した。極性輸送能は、方向間の放射能差から算出した。

本研究は、キュウリ果実ではシンプラスト画分よりもアポプラスト画分にIAAが大幅に高濃度で存在し、組織と位置によりAP/SY比が概ね4～15に及ぶと結論づけた。著者らは、このパターンがカボチャ胚軸の先行結果と整合することから、ホルモン作用に特に関係し得るAP局在IAAを踏まえてIAA生理を理解するには、AP溶液中IAAの測定が重要だと論じている。胎座と果皮でSY中IAA濃度が類似していたことは、研究対象の単為結果性キュウリ果実（種子なし）では、IAAが種子由来の供給源に限定されず果実内で広く合成される可能性の証拠として解釈された。輸送について著者らは、放射性トレーサーデータは胎座で意味のある極性輸送がほとんどないこと（移動パターンは混在し、その多くは拡散に起因すると説明）を示す一方、果皮では中程度の茎側極性があることを示すと解釈した。果実における極性輸送に関する先行文献が限られている点を強調しつつ、果皮は一定の極性を示すのに対し胎座は示さないなど、果実組織間で輸送特性が大きく異なり得ることの証拠として本結果を位置づけている。

著者らは、今後のIAA生理研究では、果実組織におけるIAA作用をより明確にするため、AP溶液中のIAA定量を優先すべきだと提案している。単為結果性果実の生物学に関する解釈に基づき、(1) 果実内で局所的に産生されたIAAは胎座領域内をゆっくり拡散し、(2) 果皮に到達したIAAは極性輸送により徐々につる（果柄）側へ運ばれ、(3) つるに入ったIAAは細いつるにおける強い極性輸送によって根の方向へ運ばれる、という作業仮説を提示した。これらは確定した機構としてではなく観察から導かれた考慮事項として示されており、果実内区画間および果実―つる軸に沿った拡散と極性輸送の相対的寄与を明らかにするため、さらなる実験が必要であることを示唆している。

インドール酢酸(植物ホルモンの一種で、IAAとも呼ばれます。茎を伸ばしたり、器官が作られる過程を調整したりします。植物の成長の進み方を左右するため重要です。)（IAA）は、植物の成長を調整する植物ホルモン(植物の体の中で少量作られ、成長や発生の進み方をコントロールする物質です。どこで作られどこへ運ばれるかが、形づくりに大きく関係します。)の一つで、特に茎が伸びることや、体のつくりが分かれていくことに強く関わります。IAAの大きな特徴として、植物の先端側から決まった向きに運ばれる極性輸送(物質が、決まった向きに偏って運ばれる仕組みです。IAAは植物体内でこの性質が強いことで知られ、成長の方向性に関わります。)があります。
これまでの研究から、IAAを受け取る受容体(IAAのような物質を受け取って、細胞に反応を起こさせるための「受け取り装置」です。受容体の場所によって、どこでIAAが効きやすいかが変わります。)は細胞膜(細胞の内側と外側を分ける膜で、物質の出入りや情報の受け取りに関わります。IAA受容体がある場所として重要です。)にあり、細胞の外側にあるアポプラスト(細胞膜の外側にある空間や、細胞壁のすき間を通る水分の通り道を指します。ここにあるIAAが直接作用に関わる可能性があり、測定が重要になります。)側に向いている可能性があると考えられてきました。また、カボチャでは、細胞の外側の液体であるアポプラストのIAA濃度が、細胞の内側の液体であるシンプラスト(細胞膜の内側で、細胞同士がつながっている部分を含む領域です。細胞内部側のIAAの状態を表すために使われます。)よりも高いことが報告されています。
しかし、IAAの研究は芽生えなどを中心に進んできて、果実を対象にした研究はほとんどありませんでした。そこで本研究ではキュウリ果実を使い、部位や組織ごとにアポプラストとシンプラストのIAA濃度を比べ、さらに果実の中で極性輸送が起こるかを確かめました。

胎座(果実の中で、種子がつく位置に関わる部分です。種子がない場合でも、IAAがどう分布するかを考える上で重要な組織です。)では、果実の基部、中央部、先端部のどの場所でも、IAA濃度はシンプラスト(細胞膜の内側で、細胞同士がつながっている部分を含む領域です。細胞内部側のIAAの状態を表すために使われます。)よりアポプラスト(細胞膜の外側にある空間や、細胞壁のすき間を通る水分の通り道を指します。ここにあるIAAが直接作用に関わる可能性があり、測定が重要になります。)のほうが高く、基部で15倍、中央部で6.5倍、先端部で5.3倍でした。果肉(食べる部分として知られる、果実の内部の柔らかい部分です。部位ごとのIAA濃度を比べる対象になりました。)でも同じ傾向で、基部5.4倍、中央部7.9倍、先端部3.9倍でした。つまりキュウリ果実では、IAAはアポプラストのほうに約4から15倍多く存在していました。
一方で、シンプラスト中のIAA濃度は胎座と果皮(果実の外側の部分です。今回、茎側への極性輸送が比較的はっきり見られた組織として重要です。)でほぼ同じでした。この結果から、今回の種子なしのキュウリ果実では、IAAが特定の場所だけで作られるのではなく、果実全体で作られている可能性があると考えられました。
IAAの移動を調べる実験では、果皮はどの領域でも茎側へ移動する傾向が安定して見られました。しかし胎座では、中央部と先端部で花側へ移動する結果も出て、向きが一定しませんでした。そこで著者らは、胎座では極性輸送(物質が、決まった向きに偏って運ばれる仕組みです。IAAは植物体内でこの性質が強いことで知られ、成長の方向性に関わります。)が弱いかほとんどなく、主に拡散(濃いところから薄いところへ自然に広がる移動のしかたです。極性輸送のような「向きの偏り」がない移動として区別されます。)で広がっている可能性が高い一方、果皮では中程度の茎側への極性があると考えました。

実験は2つ行いました。
実験Aでは、ハウス栽培のキュウリ果実を用意し、長さ方向に基部、中央部、先端部に分けて、果肉(食べる部分として知られる、果実の内部の柔らかい部分です。部位ごとのIAA濃度を比べる対象になりました。)と胎座(果実の中で、種子がつく位置に関わる部分です。種子がない場合でも、IAAがどう分布するかを考える上で重要な組織です。)からそれぞれアポプラスト(細胞膜の外側にある空間や、細胞壁のすき間を通る水分の通り道を指します。ここにあるIAAが直接作用に関わる可能性があり、測定が重要になります。)溶液とシンプラスト(細胞膜の内側で、細胞同士がつながっている部分を含む領域です。細胞内部側のIAAの状態を表すために使われます。)溶液を回収しました。切片が大きいと遠心中に細胞が壊れて中身が漏れるため、1cmの切片を使いました。まず遠心でアポプラスト溶液を取り出し、その後に凍結と解凍を行って細胞を壊してから再び遠心し、シンプラスト溶液を取り出しました。
取り出したIAAは、化学的な処理で精製したうえで、LC-MS(成分を分ける装置と、質量で見分ける装置を組み合わせた測定法です。IAAを高い精度で量り、少量でも検出できるため重要です。)という装置で量を測定しました。
実験Bでは、放射標識したIAAを使い、果実の切片を茎側向き、または花側向きに浸して、反対側にどれくらい移動したかを放射能として測定し、移動方向の差から極性輸送(物質が、決まった向きに偏って運ばれる仕組みです。IAAは植物体内でこの性質が強いことで知られ、成長の方向性に関わります。)の強さを推定しました。

キュウリ果実では、IAAはシンプラスト(細胞膜の内側で、細胞同士がつながっている部分を含む領域です。細胞内部側のIAAの状態を表すために使われます。)よりもアポプラスト(細胞膜の外側にある空間や、細胞壁のすき間を通る水分の通り道を指します。ここにあるIAAが直接作用に関わる可能性があり、測定が重要になります。)に大幅に多く存在し、その差は部位によって約4から15倍でした。この結果はカボチャでの報告と似ており、IAAの働きを理解するには、アポプラスト側のIAAを測ることが重要だと述べています。
また、シンプラスト中のIAA濃度が胎座(果実の中で、種子がつく位置に関わる部分です。種子がない場合でも、IAAがどう分布するかを考える上で重要な組織です。)と果皮(果実の外側の部分です。今回、茎側への極性輸送が比較的はっきり見られた組織として重要です。)で同程度だったことは、種子なし果実ではIAAが種子だけに依存せず、果実の広い範囲で作られている可能性を示す材料になりました。
輸送については、胎座でははっきりした極性輸送(物質が、決まった向きに偏って運ばれる仕組みです。IAAは植物体内でこの性質が強いことで知られ、成長の方向性に関わります。)がほとんど見られず、主に拡散(濃いところから薄いところへ自然に広がる移動のしかたです。極性輸送のような「向きの偏り」がない移動として区別されます。)で説明できる一方、果皮では茎側への中程度の極性輸送が見られると解釈されました。果実での極性輸送研究が少ない中で、果実の組織によって輸送の性質が大きく違う可能性を示した点が意義とされています。

著者らは今後、果実の中でIAAがどう働くかをよりはっきりさせるために、アポプラスト(細胞膜の外側にある空間や、細胞壁のすき間を通る水分の通り道を指します。ここにあるIAAが直接作用に関わる可能性があり、測定が重要になります。)溶液中のIAAを優先して測定するべきだと提案しています。さらに、観察結果にもとづく仮説として、果実内で作られたIAAは胎座(果実の中で、種子がつく位置に関わる部分です。種子がない場合でも、IAAがどう分布するかを考える上で重要な組織です。)ではゆっくり拡散(濃いところから薄いところへ自然に広がる移動のしかたです。極性輸送のような「向きの偏り」がない移動として区別されます。)し、果皮(果実の外側の部分です。今回、茎側への極性輸送が比較的はっきり見られた組織として重要です。)に達したIAAは極性輸送(物質が、決まった向きに偏って運ばれる仕組みです。IAAは植物体内でこの性質が強いことで知られ、成長の方向性に関わります。)で少しずつ茎側へ運ばれ、つるに入ったIAAはつるの強い極性輸送によって根の方向へ運ばれる、という流れを想定しています。これを確かめるには、拡散と極性輸送がどの程度それぞれ効いているのかを調べる追加実験が必要だとしています。