キュウリ果実のアポプラストには高濃度の内生植物ホルモンが存在する

アポプラスト（apoplast: AP）—細胞壁や維管束空間を含む細胞外の連続体—は、phytohormone（植物ホルモン）を含む低分子シグナル分子の輸送における重要な区画として提案されている。abscisic acid（ABA）に関する先行研究では、水ストレスなどの環境条件が細胞内pHを変化させ、その結果、組織全体のABAが上昇する前にAP溶液中のABAが増加し得ることが示唆されており、ホルモン作用が細胞膜の外側で開始されるという考えと整合的である。これを補うように、細胞表面での植物ホルモンの受容または活性を示す報告も複数ある。具体的には、孔辺細胞においてAP側に向いたABA結合部位があること、細胞外のABA conjugates（抱合体）によりABA応答性遺伝子が誘導されること、細胞外で作用するindole-3-acetic acid（IAA）類縁体が応答を引き起こし得るという証拠、さらにアリューロン組織で細胞膜に面したgibberellin（GA）受容体が報告されていること、である。こうした背景のもと、本論文は、キュウリ果実のAP溶液に特異的なphytohormone濃度を明確にすることを目的とする。液体クロマトグラフィー–質量分析（liquid chromatography–mass spectrometry: LC–MS）を用い、果実の異なる組織（pulp/fleshおよびplacenta）のAP溶液とシンプラスト（symplast: SY）溶液、ならびにpericarpの測定を行い、IAA、ABA、活性型cytokinins（CKs; tZおよびiP）、活性型GAs（GA1およびGA4）を定量することに焦点を当てた。

placentaとfleshの両方において、定量したすべてのphytohormoneは、対応するSY溶液よりもAP溶液で高濃度であった。遠心により回収された溶液重量に占めるAP溶液の割合は、placentaで11.3%、pulpで8.2%であった。IAAについては、AP濃度はplacentaのSY濃度の4.0×、fleshのSY濃度の6.5×であり、APの絶対濃度は84 pmol/gFW（placenta）および67 pmol/gFW（flesh）と報告された。活性型CKsでは、調べた各部位でtZがiPを上回った。SYに対する比として、AP中のtZはplacentaで2×、fleshで5.5×であり、AP中のiPはplacentaで2×、fleshで3×であった。GAsでは、SYに対してAP中のGA1はplacentaで8×、fleshで3.5×であり、GA4はplacentaで3×、fleshで3.5×であった。ABAは、SYに対してAPでplacentaが1.5×、fleshが2×であった。考察では組織分布のパターンにも触れられており、GA1とGA4はplacentaのAPで「高濃度（highly concentrated）」で、GA1はpericarpでも「高濃度（highly concentrated）」であった。またCKs（tZとiP）はplacentaおよびfleshよりもpericarpで高かった。著者は、これらのパターンはキュウリ果実におけるホルモンの細胞外プールが相当量存在することと整合的であり、急速な果実成長の生理と関連する可能性があると解釈している。

ハウス栽培のキュウリ（Cucumis sativus；台木「all-star Ikki」、穂木「high green 22」）を、日本の新潟市から10月上旬に入手した。この時期は昆虫による受粉が少なかったため、果実は主として単為結果により生産された。24本の果実（長さ22 cm）を氷詰めで研究室へ搬送した。両端から0.5 cmを除去後、果実を1 cm片に切断した。組織はpericarpに分け、さらにコルクボーラーを用いてplacentaとflesh/pulp成分に分離した。placentaおよびfleshのAP溶液とSY溶液は遠心により取得した。組織片をプラスチックメッシュ上に置き、4°Cで4500 g、5 min遠心してAP溶液を得た（先行研究に従う）。ホルモン抽出には安定同位体の内部標準（例：13C6-IAA、d6-ABA；d5-tZ、d6-iP、d2-GA1、d2-GA4）を用いた。IAAとABAは2段階の連続HPLC（ODS-3、次いでC-30-S-Select；いずれも40% ethanolの等速溶出）で精製し、目的の保持時間の画分を回収した。GAsとCKsは分配（pH調整を伴うethyl acetate画分およびbutanol画分）、HPLC分画（IAA/ABAの方法に類似した第2精製を含む）、および濃縮を行った。最終的な同定と定量はLC–MS（SIMモード；LCMS 2010EV, Shimadzu）で実施し、カラムはCadenza CD-C18、溶離液は70% ethanol + 30% ultrapure water + 0.1% acetic acidを用いた。濃度は、天然体と標識体のピーク面積比から算出した。単一果実から得られるAP溶液量が研究室の分析限界を下回ったため、24本の果実由来のすべてのAP/SY溶液をプールして1試料として分析し、反復測定は行えなかった。

本研究は、キュウリ果実のplacentaおよびfleshのいずれにおいても、内生のIAA、ABA、活性型CKs（tZ、iP）、活性型GAs（GA1、GA4）が、SY溶液よりAP溶液で高濃度に存在することを報告している。著者は、これらの結果は、アポプラストがphytohormone輸送とシグナル伝達における重要な経路であるという広い見方を支持すると主張する。これは、ABAについて細胞外向きの受容体結合部位があるという先行報告、細胞膜関連のGA受容（perception）が報告されていること、またIAAが細胞外で作用し得るという証拠とも整合的である。さらに本論文は、AP中のホルモン濃度が高いことで、ホルモンが合成部位から作用部位へアポプラストを介して移動し得ること、また細胞内に入らなくても受容体に結合して応答を引き起こし得ることが示唆され、その結果、急速な成長を含むキュウリ果実の生理に関連した効率的なシグナル伝達が可能になるかもしれない、と述べている。解釈には方法論上の注意点も併記されている。遠心による回収ではAPとSYが一部混合する可能性がある（ただし著者は、その場合AP–SY差は拡大ではなく縮小する方向に働くと推論している）。また、24本分をプールしたため、報告濃度は反復された生物学的推定ではなく、単一の合成測定値である。加えて、収穫後AP回収までの数時間に果実が水ストレスを受けた可能性があり、著者はこれを、過去の葉における水ストレス観察と同様に、細胞内pH変化に伴うAP中ABA増加の可能性と結び付けている。

本論文は、キュウリのpericarpでCK濃度（tZとiP）が相対的に高い理由を明らかにするため、さらなる研究が必要であると明記している。これは、果実におけるCK作用は主に細胞分裂促進に関係すると予想される一方で、キュウリのpericarpでは細胞分裂が特に活発ではないと記述されているためである。より広い観点では、本研究の所見は、果実アポプラスト中のphytohormoneが細胞外の受容体部位に到達することで直接シグナル伝達に関与し、急速な果実成長に関連する生理応答を媒介する、という提案された機能的解釈を検証する追加研究を動機づける。著者の議論は、ここで挙げた方法論上の制約に関わる未解決問題も将来研究で扱い得るとしており、具体的には、AP–SY分離のより厳密な検証、反復分析が可能な十分量のAP確保、ならびに収穫後の水ストレスがAPへのABA蓄積に与える影響と、果実のin situのホルモン状態とを切り分けることが挙げられている。

アポプラスト(細胞膜の外側にある連続した空間で、細胞壁や水・物質が通るすき間を含みます。細胞で作られた物質が外へ出たり、低分子のシグナル分子が運ばれたりする場として重要です。)（AP）は、細胞の外側にある空間で、細胞壁や水や物質が通るすき間（維管束(水や養分を運ぶ通路（道管・師管など）を含む組織です。APはこうした通路の空間ともつながり、シグナル分子の運搬に関わると考えられます。)の空間など）を含みます。ここは、植物ホルモン(植物の成長や反応（成長速度、細胞分裂、乾燥への応答など）を調整する化学物質です。少量でも大きな影響を与えるため、どこにどれだけあるかが重要になります。)のような体のはたらきを調整する小さな物質が運ばれる場所として重要だと考えられています。
これまでの研究では、乾燥などの水ストレス(乾燥などで植物が水不足になり、生理状態が変化することです。pH変化やABA増加などにつながり、今回の測定結果にも影響した可能性があるため注意点になります。)が起きると細胞内のpH(酸性・アルカリ性の度合いを示す値です。細胞内のpHが変わるとホルモンの動き方（特にAPへの移動）に影響し、反応の始まり方に関わります。)が変わり、その結果、葉全体のABA(乾燥などのストレス応答に関わる植物ホルモンで、気孔を閉じる反応などに関係します。水ストレスでAP中の濃度が先に上がることがあり、細胞外側から作用が始まる可能性が重要です。)（植物ホルモンの一種）が増えるより先に、APの液体中のABAが先に増えることが示されてきました。つまり、ホルモンの働きが細胞膜の外側から始まる可能性があります。実際に、細胞膜の外側に向いたホルモンの受け取り場所（結合部位や受容体(ホルモンなどのシグナル分子を受け取り、細胞の反応を始めるタンパク質です。細胞膜の外側に向いた受け取り部分があると、ホルモンが細胞内に入らなくても反応が起きうる点が重要です。)）がある、という報告もあります。
そこでこの研究は、キュウリ果実のAP液体の中に、植物ホルモンがどれくらい含まれているのかをはっきりさせることを目的としました。果実の部位（flesh(果実の食べる部分にあたる組織です。placentaと比べて、APとSYの差やホルモン量の傾向を調べる対象になりました。)/pulpとplacenta(キュウリ果実の種に近い中心部の組織です。ホルモン濃度の特徴が出やすく、GAが高い部位として注目されました。)）ごとに、APとシンプラスト(細胞膜の内側どうしがつながった領域で、細胞質側を通って物質が移動する範囲を指します。APと比べることで、細胞外と細胞内のどちらにホルモンが多いかを判断できます。)（SY）の液体、さらにpericarp(果実の外側の果皮部分です。サイトカイニンが相対的に高いなど、他の部位と違うパターンが見られたため、今後の研究課題になっています。)について、LC–MS(液体クロマトグラフィーで分離し、質量分析で物質を見分けて量を測る方法です。植物ホルモンのような微量物質を高い精度で定量できるため、本研究の中心的な測定法です。)という方法でIAA(オーキシンと呼ばれる植物ホルモンの代表例で、伸長成長などに関わります。細胞内に入らなくても細胞膜の外側で働きうる可能性が議論されています。)、ABA、活性型サイトカイニン(主に細胞分裂を進める働きがある植物ホルモンの仲間です。果実の成長や部位ごとの役割と結びつくため、どの部分に多いかが研究の焦点になります。)（tZ(代表的な活性型サイトカイニンの一つで、細胞分裂や成長調節に関わります。この研究では多くの部位でiPより濃度が高く、部位差の理解に役立ちます。)とiP(活性型サイトカイニンの一つで、tZと並んで量が測られます。どの部位で増えるかは、サイトカイニンの移動や働きを考える手がかりになります。)）、活性型ジベレリン(茎や果実の伸びなど成長促進に関わる植物ホルモン群です。合成場所から別の場所へ移動して働くことが多く、AP中の存在は輸送経路の理解につながります。)（GA1(活性型ジベレリンの一つで、成長促進に関わります。placentaのAPやpericarpで高いことが、果実の成長との関係として注目されます。)とGA4(活性型ジベレリンの一つで、GA1と並んで成長に関わります。APで高濃度だったことが、細胞外プールの重要性を考える材料になります。)）を量りました。

placenta(キュウリ果実の種に近い中心部の組織です。ホルモン濃度の特徴が出やすく、GAが高い部位として注目されました。)とflesh(果実の食べる部分にあたる組織です。placentaと比べて、APとSYの差やホルモン量の傾向を調べる対象になりました。)のどちらでも、調べたすべての植物ホルモン(植物の成長や反応（成長速度、細胞分裂、乾燥への応答など）を調整する化学物質です。少量でも大きな影響を与えるため、どこにどれだけあるかが重要になります。)は、SYの液体よりAPの液体のほうが濃度が高くなっていました。遠心(高速回転で液体成分を取り出す操作です。AP液体とSY液体を回収するのに使われますが、両者が少し混ざる可能性があるため解釈に注意が必要です。)で回収できた液体のうち、AP液体の割合はplacentaで11.3%、pulpで8.2%でした。
IAA(オーキシンと呼ばれる植物ホルモンの代表例で、伸長成長などに関わります。細胞内に入らなくても細胞膜の外側で働きうる可能性が議論されています。)は、APがSYの4.0倍（placenta）と6.5倍（flesh）で、APの濃度はplacentaで84 pmol(非常に小さい量の物質の量を表す単位で、ピコモルと読みます。ホルモンは微量で働くため、この単位で濃度が表されます。)/gFW(新鮮な状態の重さ（fresh weight）1 gあたり、という意味です。水分を含んだ果実の組織で濃度を比べるときに使われます。)、fleshで67 pmol/gFWでした。
活性型サイトカイニン(主に細胞分裂を進める働きがある植物ホルモンの仲間です。果実の成長や部位ごとの役割と結びつくため、どの部分に多いかが研究の焦点になります。)では、どの部位でもtZ(代表的な活性型サイトカイニンの一つで、細胞分裂や成長調節に関わります。この研究では多くの部位でiPより濃度が高く、部位差の理解に役立ちます。)がiP(活性型サイトカイニンの一つで、tZと並んで量が測られます。どの部位で増えるかは、サイトカイニンの移動や働きを考える手がかりになります。)より多く、AP中のtZはSYの2倍（placenta）と5.5倍（flesh）、AP中のiPはSYの2倍（placenta）と3倍（flesh）でした。
ジベレリン(茎や果実の伸びなど成長促進に関わる植物ホルモン群です。合成場所から別の場所へ移動して働くことが多く、AP中の存在は輸送経路の理解につながります。)では、AP中のGA1(活性型ジベレリンの一つで、成長促進に関わります。placentaのAPやpericarpで高いことが、果実の成長との関係として注目されます。)がSYの8倍（placenta）と3.5倍（flesh）、GA4(活性型ジベレリンの一つで、GA1と並んで成長に関わります。APで高濃度だったことが、細胞外プールの重要性を考える材料になります。)がSYの3倍（placenta）と3.5倍（flesh）でした。ABA(乾燥などのストレス応答に関わる植物ホルモンで、気孔を閉じる反応などに関係します。水ストレスでAP中の濃度が先に上がることがあり、細胞外側から作用が始まる可能性が重要です。)はAPがSYの1.5倍（placenta）と2倍（flesh）でした。
部位ごとの特徴として、GA1とGA4はplacentaのAPで特に高く、GA1はpericarp(果実の外側の果皮部分です。サイトカイニンが相対的に高いなど、他の部位と違うパターンが見られたため、今後の研究課題になっています。)でも特に高いと述べられています。一方、サイトカイニン（tZとiP）はplacentaやfleshよりpericarpで高い傾向がありました。著者は、こうした結果は「細胞外（AP）にかなりの量のホルモンがたまっている」ことと合っており、キュウリ果実の速い成長に関係している可能性があると考えています。

ハウス栽培のキュウリ果実を24本集め、氷で冷やして研究室に運びました。両端を少し切り落としてから1 cm厚に切り、pericarp(果実の外側の果皮部分です。サイトカイニンが相対的に高いなど、他の部位と違うパターンが見られたため、今後の研究課題になっています。)を分け、さらに道具を使ってplacenta(キュウリ果実の種に近い中心部の組織です。ホルモン濃度の特徴が出やすく、GAが高い部位として注目されました。)とflesh(果実の食べる部分にあたる組織です。placentaと比べて、APとSYの差やホルモン量の傾向を調べる対象になりました。)/pulpに分けました。placentaとfleshは遠心(高速回転で液体成分を取り出す操作です。AP液体とSY液体を回収するのに使われますが、両者が少し混ざる可能性があるため解釈に注意が必要です。)してAP液体とSY液体を回収しました（4°Cで4500 g、5分）。
ホルモンの量を正確に測るために、安定同位体(性質はほぼ同じでも重さが少し違う原子を使った目印です。内部標準として使うと、LC–MSで区別でき、正確な定量に役立ちます。)で印をつけた内部標準(測定の誤差を小さくするために、あらかじめ決まった量だけ加える「目印」になる物質です。天然のホルモンと比べて量を計算できるので、定量の信頼性が上がります。)を加え、HPLC(液体の中の成分をカラムで分けて取り出す分析法です。ホルモンのような微量成分をきれいに分けてから測るために使われます。)で成分を分けてから、LC–MS(液体クロマトグラフィーで分離し、質量分析で物質を見分けて量を測る方法です。植物ホルモンのような微量物質を高い精度で定量できるため、本研究の中心的な測定法です。)で同定と定量をしました。
ただし、キュウリ1本から取れるAP液体が少なすぎて繰り返し測定ができなかったため、24本分をまとめて1つの試料として測定しました。

この研究は、キュウリ果実のplacenta(キュウリ果実の種に近い中心部の組織です。ホルモン濃度の特徴が出やすく、GAが高い部位として注目されました。)とflesh(果実の食べる部分にあたる組織です。placentaと比べて、APとSYの差やホルモン量の傾向を調べる対象になりました。)で、IAA(オーキシンと呼ばれる植物ホルモンの代表例で、伸長成長などに関わります。細胞内に入らなくても細胞膜の外側で働きうる可能性が議論されています。)、ABA(乾燥などのストレス応答に関わる植物ホルモンで、気孔を閉じる反応などに関係します。水ストレスでAP中の濃度が先に上がることがあり、細胞外側から作用が始まる可能性が重要です。)、活性型サイトカイニン(主に細胞分裂を進める働きがある植物ホルモンの仲間です。果実の成長や部位ごとの役割と結びつくため、どの部分に多いかが研究の焦点になります。)（tZ(代表的な活性型サイトカイニンの一つで、細胞分裂や成長調節に関わります。この研究では多くの部位でiPより濃度が高く、部位差の理解に役立ちます。)、iP(活性型サイトカイニンの一つで、tZと並んで量が測られます。どの部位で増えるかは、サイトカイニンの移動や働きを考える手がかりになります。)）、活性型ジベレリン(茎や果実の伸びなど成長促進に関わる植物ホルモン群です。合成場所から別の場所へ移動して働くことが多く、AP中の存在は輸送経路の理解につながります。)（GA1(活性型ジベレリンの一つで、成長促進に関わります。placentaのAPやpericarpで高いことが、果実の成長との関係として注目されます。)、GA4(活性型ジベレリンの一つで、GA1と並んで成長に関わります。APで高濃度だったことが、細胞外プールの重要性を考える材料になります。)）が、SYよりAPで高濃度になっていることを示しました。
著者はこれを、アポプラスト(細胞膜の外側にある連続した空間で、細胞壁や水・物質が通るすき間を含みます。細胞で作られた物質が外へ出たり、低分子のシグナル分子が運ばれたりする場として重要です。)が植物ホルモン(植物の成長や反応（成長速度、細胞分裂、乾燥への応答など）を調整する化学物質です。少量でも大きな影響を与えるため、どこにどれだけあるかが重要になります。)の運ばれ方や情報伝達にとって重要な通り道である、という考えを後押しする結果だと述べています。細胞膜の外側で受け取られる可能性があるホルモン（ABAやGAなど）の報告や、IAAが細胞外でも働きうるという報告ともつながります。
さらに、ホルモンがAPを通って合成場所から作用場所へ移動し、細胞内に入らなくても受容体(ホルモンなどのシグナル分子を受け取り、細胞の反応を始めるタンパク質です。細胞膜の外側に向いた受け取り部分があると、ホルモンが細胞内に入らなくても反応が起きうる点が重要です。)に結びついて反応を起こせるなら、キュウリ果実の急速な成長のような反応が効率よく起きるかもしれない、と示唆しています。
一方で注意点として、遠心(高速回転で液体成分を取り出す操作です。AP液体とSY液体を回収するのに使われますが、両者が少し混ざる可能性があるため解釈に注意が必要です。)でAPとSYが少し混ざる可能性があること、24本分をまとめた1回測定で反復がないこと、収穫後に水ストレス(乾燥などで植物が水不足になり、生理状態が変化することです。pH変化やABA増加などにつながり、今回の測定結果にも影響した可能性があるため注意点になります。)がかかってABAがAPで増えた可能性があることも述べています。

今後の課題として、pericarp(果実の外側の果皮部分です。サイトカイニンが相対的に高いなど、他の部位と違うパターンが見られたため、今後の研究課題になっています。)でサイトカイニン(主に細胞分裂を進める働きがある植物ホルモンの仲間です。果実の成長や部位ごとの役割と結びつくため、どの部分に多いかが研究の焦点になります。)（tZ(代表的な活性型サイトカイニンの一つで、細胞分裂や成長調節に関わります。この研究では多くの部位でiPより濃度が高く、部位差の理解に役立ちます。)とiP(活性型サイトカイニンの一つで、tZと並んで量が測られます。どの部位で増えるかは、サイトカイニンの移動や働きを考える手がかりになります。)）が相対的に高い理由を調べる必要があるとしています。サイトカイニンは果実では主に細胞分裂を進める働きがあると考えられますが、キュウリのpericarpでは細胞分裂が特に活発ではないとされるためです。
また、提案されたしくみ（AP中のホルモンが細胞外の受容体(ホルモンなどのシグナル分子を受け取り、細胞の反応を始めるタンパク質です。細胞膜の外側に向いた受け取り部分があると、ホルモンが細胞内に入らなくても反応が起きうる点が重要です。)に届いて直接シグナルを伝え、速い果実成長に関わる）を確かめるために、APとSYの分離の確かさの検証、反復測定できる量のAP確保、収穫後の水ストレス(乾燥などで植物が水不足になり、生理状態が変化することです。pH変化やABA増加などにつながり、今回の測定結果にも影響した可能性があるため注意点になります。)の影響の切り分けなどが必要だとしています。