若齢および老齢マウスの長趾伸筋における側方力伝達の計測

骨格筋の力は、筋線維（myofiber）内でのアクチン–ミオシンのクロスブリッジサイクルによって生み出されるが、筋力はその力が腱へどのように伝達されるかにも同等に依存する。本論文は、力の伝達経路を2つに区別している。すなわち、筋腱接合部（myotendinous junction: MTJ）を介した縦方向の力伝達（longitudinal force transmission）と、筋線維表面から周囲の結合組織へ、さらに腱へと力が移される横方向の力伝達（lateral force transmission）である。ラットやマウスの筋を用いた先行実験では、両端で腱に付着する「spanning」筋であっても、横方向の伝達が総力の大きな割合（約80%）を占めることが示唆されていた。著者らはこのテーマをサルコペニア（sarcopenia）とも関連づけ、加齢に伴う筋力低下は筋量低下より速く進むこと、また高齢者でも単一筋線維の収縮特性が保たれうることから、筋線維以外の要因が筋力低下に寄与する可能性を強調している。加齢は筋の結合組織（例：線維化）を変化させるため、横方向の力伝達の加齢変化が筋力低下に寄与しうると著者らは提案する。本研究の目的は、tenotomy/myotomy（腱切離／筋切離）に基づく手法を改変して、マウスの小さな extensor digitorum longus（EDL）筋で横方向の力伝達を定量化し、加齢がこの伝達に与える影響を調べることであった。

段階的な tenotomy と myotomy のプロトコルを通じて、若齢・老齢いずれのマウス EDL 筋でも、横方向の力伝達が相当程度寄与していることと整合する有意な力の低下が観察された。総寄与率として定量すると、若齢マウスでは横方向の伝達が総力のおよそ80%を占め、他種・他条件の先行報告と一致した。老齢マウスでは、算出された横方向の寄与率が若齢より低い傾向を示したが、老齢群のばらつきが大きかったため、この年齢差は統計学的有意には至らなかった。中間段階の力を初期の筋全体の強縮力（F0）で正規化すると、若齢群ではなく老齢群で、著者らが「加齢により縦方向の力伝達への依存が増すことを示す」と解釈した比較において有意差が認められた。さらに、絶対的な最大強縮力と、断面積で正規化した比強縮力（specific tetanic force）も、加齢に伴って低下する傾向を示したが、ここでも老齢動物のばらつきのため群間差は統計学的有意ではなかった。機序に関して、dystrophin の免疫染色は若齢と老齢で強度・局在が同程度であり、このデータセットでは dystrophin 発現パターンに加齢関連の変化がないことを示唆した。一方、collagen III 染色では、老齢筋で結合組織量が有意に増加しており、著者らはこれを力伝達効率の変化と関連しうる要因として強調している。

本研究では、13週齢（若齢）および28か月齢（老齢）の雄 C57BL/6 マウスを用いた。摘出した EDL 筋を in vitro の収縮性測定システムに装着し、遠位および近位の腱を 5–0 の絹糸で結紮した。筋は哺乳類用 Ringer 溶液（NaCl 137 mM, NaHCO3 24 mM, glucose 11 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, MgSO4 1 mM, NaH2PO4 1 mM, tubocurarine chloride 0.025 mM）中で試験し、pH 7.4 の 95% O2/5% CO2 で平衡化し、23 °C に維持した。最大単収縮張力（maximal twitch tension）を生じる電流の20%上を超最大刺激（supramaximal stimulation）とした。最適長は、伸張して単収縮張力が増加しなくなるまで行って決定した。最大強縮力は、150 Hz の 300 ms train で 1.0 ms パルスを用いて誘発した。横方向の伝達は、特定の EDL head に対して縦方向、その後に横方向の結合を順次除去する tenotomy と myotomy の系列により推定した。ラットのプロトコルに基づきつつ、マウス筋のサイズにより必要となった改変として、head II と III を一体として扱い（腱は同時に切断し、両者間の myotomy は省略）、その後に head IV から分離した；同様の手順を head IV にも適用した。各段階後の力（F0, F0 2_3, F2_3, F'4, F4）を記録し、F0 で正規化して横方向寄与率を算出した。試験後に筋長と筋重量を測定し、比筋力（specific force）は筋量／筋長と密度 1.066 mg/mm3 から求めた生理学的断面積を用いて計算した。右・左 EDL の値は個体ごとに平均した。別個体のマウスを用い、7 μm の凍結切片で dystrophin と collagen III を免疫蛍光染色し、Keyence Hybrid Cell Count アプリケーションで定量した。解析はブラインド化して行い、統計は2群比較に対応のない両側 Student’s t-test、多群比較に one-way ANOVA と Holm–Šídák の事後検定を用いた（p < 0.05）。

著者らは、改変した tenotomy/myotomy 手順によって、マウス EDL 筋における横方向の力伝達を測定できると結論づけており、これは従来マウスでは技術的障壁として指摘されていた点に対応するものである。実験的には、若齢マウスで横方向の寄与がおよそ80%であったことから、横方向の力伝達が骨格筋における主要経路であるという広い主張を支持し、先行研究とも整合した。加齢については、老齢筋で横方向の伝達効率が低下し、あるいは縦方向伝達への依存が増す方向への変化が示唆されたが、横方向寄与率の全体比較における中心的な年齢差は、老齢マウスの測定値の変動が大きかったため統計学的有意に至らなかった。免疫組織学的所見として、この条件下では加齢により結合組織量（collagen III 陽性領域）が増加する一方、dystrophin 染色は年齢群間で検出可能な差がなかった。著者らはこれらを、筋線維固有の収縮能が比較的保たれている場合でも、加齢に伴う結合組織のリモデリングが力伝達特性を変化させ、結果として筋力低下に寄与しうるというモデルを支持する観察として解釈している。方法論的には、マウスで実行可能なアッセイを確立することが重要な一歩であり、マウス遺伝学を活用して力伝達障害の機序を解明できると位置づけられている。

本論文は、筋の力伝達、特に結合組織を介する横方向の伝達を制御する分子機構の同定が、今後の重要課題であると主張する。著者らは、マウスに基づく測定アプローチを遺伝子改変マウスモデルに適用し、特定の分子や経路が横方向の力伝達と筋力に与える影響を検証できると提案している。自らのデータと先行のモデリングに基づき、結合組織の厚さ／体積を伝達効率の候補決定因子として挙げ、結合組織の硬さ（stiffness）など追加の性質も加齢関連の変化に寄与しうると述べている。また、dystrophin および dystrophin–glycoprotein complex を機序的に関連のある要素として位置づけつつも、自身の所見（dystrophin 染色に年齢差がない）とラットでの相反する文献から、dystrophin レベルの低下のみで加齢関連変化を説明できる可能性は低いと強調している。総じて、著者らは本手法を、extracellular matrix／結合組織の変化を機能的な筋力の結果と結びつけるツールとして、多様な実験マウスモデルに展開し、加齢に伴う筋力低下における筋線維以外の寄与因子の解明に資するものと見込んでいる。

骨格筋(骨について体を動かすための筋肉です。自分の意思で動かしやすく、運動や姿勢の維持に関わります。)は、筋線維(筋肉を作る細長い細胞のことです。1本1本が収縮して力を生み出します。)の中で起こるアクチン(筋線維の中にあるタンパク質で、ミオシンと組み合わさって収縮を起こす材料の1つです。)とミオシン(筋線維の中にあるタンパク質で、アクチンを引っ張ることで筋収縮の力を生み出します。)の働きによって力を生み出します。しかし、筋力は「力を作ること」だけでなく、その力が腱(筋肉と骨をつなぐ丈夫な組織です。筋肉が作った力を骨に伝えて体を動かします。)を通して骨に「うまく伝わること」も同じくらい重要です。
この研究では、力の伝わり方を2種類に分けています。1つは筋線維の端が腱につながる部分を通って力がまっすぐ伝わる方法、もう1つは筋線維の表面から周りの結合組織(筋線維の周りを支えたりまとめたりする組織です。力を伝える役目もあり、増えすぎたり性質が変わると筋の働きに影響します。)に力が移り、そこから腱へ伝わる方法です。先行研究では、筋線維の両端が腱につながっている筋でも、後者の伝わり方が全体の大きな割合を占める可能性が示されていました。
また、加齢による筋力低下は筋肉の量の減少よりも速く進むことがあり、筋線維そのものの収縮能力が保たれている場合もあります。そこで著者らは、筋線維以外の要因、特に結合組織の変化が力の伝わり方を変えて筋力低下につながる可能性に注目しました。
本研究の目的は、マウスのEDL筋(足の指を伸ばす働きに関わる筋肉の1つで、研究でよく使われる筋です。正式には長趾伸筋です。)という小さな筋肉で、力が横方向に伝わる割合を測れるように方法を工夫し、若いマウスと年をとったマウスで違いがあるかを調べることです。

腱(筋肉と骨をつなぐ丈夫な組織です。筋肉が作った力を骨に伝えて体を動かします。)を切る操作と、筋の一部を切り分ける操作を段階的に行うと、若いマウスでも年をとったマウスでも、測定される力がはっきり低下しました。これは、力が横方向にもかなり伝わっていることと合っています。
計算すると、若いマウスでは横方向の力の伝達が全体の約80%を占め、先行研究の結果とも一致しました。年をとったマウスでは、この割合が若い群より低い傾向がありましたが、個体差が大きく、統計的に「差がある」とまでは言えませんでした。
一方で、測定値を最初の最大の力でそろえて比べたとき、年をとった群では「まっすぐ伝わる力の伝達への頼り方が増える」と解釈できる結果が一部で有意に見られました。
仕組みの手がかりとして、筋線維(筋肉を作る細長い細胞のことです。1本1本が収縮して力を生み出します。)の表面にあるタンパク質であるジストロフィン(筋線維の内側の骨組みと外側の環境をつなぐのに関わるタンパク質です。力を周囲へ伝える助けになると考えられています。)は、若い群と年をとった群で染まり方に大きな違いがありませんでした。しかし、結合組織(筋線維の周りを支えたりまとめたりする組織です。力を伝える役目もあり、増えすぎたり性質が変わると筋の働きに影響します。)の量を示すコラーゲンIII(結合組織を作る材料の1つです。量が増えると結合組織が厚くなったり性質が変わる目安になります。)は、年をとった筋で有意に増えていました。著者らは、この結合組織の増加が力の伝わりやすさの変化と関係する可能性を重視しています。

若い（13週齢）マウスと、年をとった（28か月齢）マウスのEDL筋(足の指を伸ばす働きに関わる筋肉の1つで、研究でよく使われる筋です。正式には長趾伸筋です。)を取り出し、実験装置に取り付けて電気刺激で収縮させ、最大の強縮力(筋肉に高い頻度で刺激を与えて、力が途切れずに最大に近い状態で出続けるときの力です。筋の最大能力を調べる指標になります。)などを測定しました。
その後、EDL筋の各部分について、腱(筋肉と骨をつなぐ丈夫な組織です。筋肉が作った力を骨に伝えて体を動かします。)を切って「まっすぐ伝わる力」を減らす段階と、筋を切り分けて「横方向に伝わる力」も減らす段階を順番に行い、各段階で出る力を記録しました。マウスのEDL筋は小さく壊れやすいため、一部の部位はまとめて扱うなど、ラット用の方法をマウス向けに改変しました。
さらに、別のマウスの筋から薄い切片を作り、ジストロフィン(筋線維の内側の骨組みと外側の環境をつなぐのに関わるタンパク質です。力を周囲へ伝える助けになると考えられています。)とコラーゲンIII(結合組織を作る材料の1つです。量が増えると結合組織が厚くなったり性質が変わる目安になります。)を染色して、量や分布を画像解析で比べました。統計解析を行い、偶然の差ではないかを確認しました。

著者らは、改変した手順によってマウスのEDL筋(足の指を伸ばす働きに関わる筋肉の1つで、研究でよく使われる筋です。正式には長趾伸筋です。)でも横方向の力の伝達を測定できると結論づけています。これは、これまでマウスでは技術的に難しいとされてきた点を前進させる成果です。
若いマウスで横方向の伝達が約80%だったことは、骨格筋(骨について体を動かすための筋肉です。自分の意思で動かしやすく、運動や姿勢の維持に関わります。)では横方向の伝達が主要なルートになりうるという考えを支持します。
加齢については、年をとった筋で横方向の伝達が弱くなる、またはまっすぐ伝わる伝達への依存が増える可能性が示されましたが、全体としての年齢差は個体差が大きく、はっきり断定できるところまでは至りませんでした。
一方で、結合組織(筋線維の周りを支えたりまとめたりする組織です。力を伝える役目もあり、増えすぎたり性質が変わると筋の働きに影響します。)が増えることが確認され、筋線維(筋肉を作る細長い細胞のことです。1本1本が収縮して力を生み出します。)の収縮能力が比較的保たれていても、結合組織の変化が力の伝わり方を変えて筋力低下につながる、という考えを支える観察だと述べています。

今後は、結合組織(筋線維の周りを支えたりまとめたりする組織です。力を伝える役目もあり、増えすぎたり性質が変わると筋の働きに影響します。)を介する横方向の力の伝達が、どんな分子の働きで決まるのかを明らかにすることが重要だとしています。マウスは遺伝子を変えたモデルを作りやすいため、本研究の測定法を使えば、特定の分子や仕組みが力の伝達や筋力にどう影響するかを調べやすくなります。
また、結合組織の量や厚みだけでなく、硬さなどの性質も加齢の影響に関わるかもしれないと述べています。ジストロフィン(筋線維の内側の骨組みと外側の環境をつなぐのに関わるタンパク質です。力を周囲へ伝える助けになると考えられています。)なども関係が疑われる一方、年齢差が見られない結果もあるため、ジストロフィンの量の変化だけで説明するのは難しそうだとしています。全体として、この手法は加齢による筋力低下で「筋線維(筋肉を作る細長い細胞のことです。1本1本が収縮して力を生み出します。)以外」がどれくらい効いているのかを調べる助けになると期待されています。