HBxとYAPの発現はHBV関連肝細胞癌の発生と進行を促進する

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma: HCC）は原発性肝癌の大部分を占め、HBV関連HCCは全体の約10%〜20%を占める。臨床的に、HBV関連HCCはHCV関連HCCと比べて、より若年での発症、より大きな腫瘍、そして生存率不良を特徴とすることが多い。これらの特徴は、慢性炎症、HBV-DNAの組み込み、ならびに宿主のがん化シグナルを調節するウイルスタンパク質と関連づけられてきた。重要なウイルス因子としてhepatitis B virus X（HBx）があり、複数の経路（例：Wnt-β-catenin、JAK/STAT、RAS、Hippo signaling）に影響する。Hippo signalingにおいては、Yes-associated protein（YAP）が転写共活性化因子として機能し、核内で活性化すると増殖を促進し、アポトーシスを抑制する。先行する実験研究では、HBxがYAP発現と核内集積を増加させ、肝発癌を促進しうることが示唆されていた。しかし、ヒトHCCにおける腫瘍組織と腫瘍周囲（peritumor）組織でのHBxおよびYAPの発現パターン、ならびに臨床病理学的特徴や予後との関係は、体系的には評価されていなかった。本研究は、切除されたヒトHCC組織におけるHBxとYAPタンパク質発現を定量し、HBV関連HCCを他の病因と比較し、腫瘍サイズ、血清α-fetoprotein（AFP）、組織学的所見、無増悪生存期間（PFS）との関連を評価することを目的とした。さらに、HBxおよび／またはYAPを過剰発現させたhepatoma細胞におけるトランスクリプトーム解析でこれを補完した。

HBV関連HCC 19例のうち、63%（12/19）が腫瘍および／または腫瘍周囲組織でHBx陽性（>5%）であった。これら陽性例では、HBx染色面積は腫瘍周囲（9.8% ± 7.2%）と腫瘍（7.7% ± 3.7%）で同程度であった。予想どおり、HCV関連および非ウイルス関連HCCでは、有意なHBx染色は認められなかった。HBV関連HCCでは、HBx染色面積は腫瘍サイズおよび血清AFP値と有意に相関した。YAP陽性は病因を問わず一般的にみられたが、HBV関連HCCの腫瘍で最も顕著であった。HBV関連19例の84%（16/19）が腫瘍および／または腫瘍周囲組織でYAP陽性であり、腫瘍は腫瘍周囲に比べて染色が大きく増加していた（19.3% ± 2.5% vs 4.9% ± 0.5%）。HCV関連HCCでも腫瘍のYAPは腫瘍周囲より高かった（8.1% ± 1.3% vs 2.6% ± 0.2%）が、腫瘍での染色はHBV関連HCCより低かった。非ウイルス関連HCCでは80%（15/19）がYAP陽性であったが、腫瘍と腫瘍周囲の明確な差はみられなかった。全サンプルを通じて、YAP染色面積は腫瘍サイズと有意に相関し、AFPとの関連は有意ではない傾向にとどまった。HBV関連腫瘍での共発現解析では、63%（12/19）がHBxとYAPの両方に陽性で、4/19はYAPのみ陽性、3/19は両方陰性であり、HBxのみ陽性の腫瘍はなかった。臨床的には、両方陰性の腫瘍は高〜中分化である傾向があり、YAP陽性群よりPFSが良好である傾向がみられた。両陽性群の中では、低分化例でPFSが特に短く（例：低分化サブセットで64日が報告）、高分化の両陽性例（例：539日）より短かった。HBxおよび／またはYAPを過剰発現させたhepatoma細胞株のトランスクリプトーム解析では、DNA複製、細胞周期制御、増殖、がん化シグナルに関連する経路や遺伝子セットの富化が示唆された。また、YAP過剰発現はHBx過剰発現よりも、MAPK、NF-κB、RAS、TNF signaling pathway関連遺伝子の活性化が相対的に高いことが示された。

本研究では、化学療法またはchemoembolizationの既往がない患者から、新潟大学病院で収集された外科切除HCC検体を検討した。コホートは、2012〜2019年に切除されたstage I HCC（American Joint Committee on Cancerのtumor–node–metastasis分類）54例で、内訳はHBV関連19例、HCV関連17例、非ウイルス関連19例であった（非ウイルス群はnonalcoholic steatohepatitis 6例とalcoholic liver injury 13例から構成）。腫瘍および腫瘍周囲組織は、hematoxylin and eosin染色と、抗YAP（No. 4912, Cell Signaling Technology; 1:100）および抗HBx（ab39716, Abcam; 1:500）を用いた免疫組織化学により組織学的に評価した。各組織切片から画像を無作為に取得し、陽性染色領域をImageJ（著者らが既報したRGBベースのプロトコル）で定量した。染色面積と腫瘍サイズまたは血清AFPとの関連はPearsonの相関で評価した。群間比較には、対応のあるt検定およびカテゴリ変数に対するMann-Whitney-Wilcoxon検定を用い、統計学的有意差はp < 0.05とした。HBxとYAPに関連する遺伝子発現変化を検討するため、hepatoma細胞株（HLE、HepG2、Hep3B2.1-7）に、YAP（pLIVE-based）および／またはHBx（pCMV6-Entry Tagged vector）を発現するプラスミドを導入した。全トランスクリプト発現アレイ（Affymetrix）を用いて差次的発現およびバイオインフォマティクス解析（GO enrichment、KEGG pathway analysis；詳細はSupplementary Materials参照）を行った。細胞増殖への影響は、96ウェル形式でのWST-1 assay（2 × 10^4 cells/well）でも追加評価した。

本研究は、ヒトHBV関連HCCにおいて、HBxタンパク質発現が腫瘍負荷の増大および血清AFP高値と関連し、またYAP発現が腫瘍周囲組織に比べて腫瘍組織で強く富化しており、とくにHBV関連症例で顕著であると結論づけた。腫瘍組織におけるHBxとYAPの共存は一般的であり、コホート内の臨床パターンからは、両タンパク質を発現する腫瘍は悪性度が高い可能性が示唆された。これは、一部で分化度が不良であること、ならびに両マーカー陰性腫瘍と比べてPFSが不良であることに反映されていた。著者らは、これらのデータを、HBV関連の肝発癌と腫瘍進展におけるHBx–YAP axisを支持するものと解釈し、HBxがYAP発現と核内活性を促進しうるという先行実験知見とも整合すると述べている。補完的なトランスクリプトーム解析では、HBxおよび／またはYAP過剰発現のhepatoma細胞で、細胞周期、DNA複製、複数のがん関連シグナル経路の活性化が示され、このaxisの増殖促進・がん化促進的役割と一致した。著者らが述べる意義としては、HBV感染肝におけるYAP発現がHBV関連HCCの発生における重要因子である可能性があり、また、現時点で肝細胞からHBVを根絶する承認済み戦略がないことを踏まえると、治療標的となり得る点が挙げられた。

著者らは、本研究には限界があり、特にサンプルサイズが小さいこと、ならびにHBx陽性肝細胞におけるYAP発現がin vivoで腫瘍サイズ増大と進展にどのように寄与するかの機序が十分に解明されていないことから、さらなる研究が必要だと強調している。将来の研究として、HBxとYAP発現に伴う不均一性や細胞状態変化をより明確にするため、single-cell assayを含む、より詳細な細胞ベースの表現型解析を取り入れることを提案している。さらに、観察された臨床相関の背後にある因果経路を確立するため、HBxおよびYAPの遺伝子導入と、in vivoでの肝発癌の機序評価を行う実験が必要だとしている。論文ではYAPをHBV関連HCCの潜在的治療標的として位置づけているが、これは本研究の知見と先行研究により支持される方向性として述べられており、臨床的に確立した介入としてではなく、トランスレーショナル開発を進めるにはより深い機序的検証が必要であるとしている。

肝細胞癌(肝臓の細胞から発生するがんで、肝がんの中で最も多いタイプです)は、肝臓にできるがんの中でいちばん多いタイプです。その中でもB型肝炎ウイルスHBV(B型肝炎ウイルスのことで、感染が続くと肝炎や肝硬変、肝がんの原因になります)が原因の肝細胞癌は全体の約10%〜20%を占めます。HBVが原因の肝細胞癌は、C型肝炎ウイルスHCV(C型肝炎ウイルスのことで、長期間の感染が肝がんにつながることがあります)が原因のものより、若い年齢で起こりやすい、腫瘍が大きくなりやすい、生存率が低くなりやすいといった特徴があるとされています。
これまで、その理由として、肝臓で炎症が長く続くことや、HBVの遺伝情報が人の細胞のDNAに入り込むこと、そしてウイルスが作るタンパク質が人の細胞のがん化に関わる仕組みを動かすことなどが関係すると考えられてきました。特にHBx(HBVが作るタンパク質で、細胞の増殖やがん化に関わる複数の仕組みに影響しうるとされます)というウイルスのタンパク質が重要だとされ、いくつもの細胞内の仕組みに影響します。
またHippo signaling(細胞の増えすぎを抑える仕組みで、この働きが弱まると増殖が進みやすくなります)という仕組みでは、YAP(Hippo signalingに関わるタンパク質で、核の中で働くと細胞増殖を促し、細胞死を起こりにくくします)というタンパク質が細胞の増殖を進めたり、細胞の自殺（アポトーシス(傷ついた細胞などが自分から死ぬ仕組みで、がんを防ぐ役割もあります)）を起こりにくくしたりします。実験では、HBxがYAPを増やし、YAPが細胞の核の中で働きやすくなることで、がんが進みやすくなる可能性が示されていました。
しかし、人の肝細胞癌で「腫瘍の部分」と「腫瘍の周りの部分」でHBxとYAPがどのくらい出ているか、そしてそれが腫瘍の大きさや予後とどう関係するかは、まとめて詳しく調べられていませんでした。そこで本研究は、手術で切除した人の肝細胞癌を使い、HBxとYAPの量を比べ、腫瘍サイズや血液検査のAFP(肝細胞癌などで高くなりやすい血液中の物質で、腫瘍マーカーとして使われます)、組織の特徴、PFS(治療後などに、がんが悪化せずに保たれた期間を表す指標です)（悪化せずに過ごせた期間）との関係を調べました。さらに、肝がん細胞にHBxやYAPを多く作らせて、遺伝子の働き方の変化も調べました。

HBV(B型肝炎ウイルスのことで、感染が続くと肝炎や肝硬変、肝がんの原因になります)が原因の肝細胞癌(肝臓の細胞から発生するがんで、肝がんの中で最も多いタイプです)19例のうち、63%で腫瘍と腫瘍周囲のどちらか、または両方にHBx(HBVが作るタンパク質で、細胞の増殖やがん化に関わる複数の仕組みに影響しうるとされます)が見られました。HBxの出方は腫瘍周囲と腫瘍でだいたい同じ程度でした。予想どおり、HCV(C型肝炎ウイルスのことで、長期間の感染が肝がんにつながることがあります)が原因の肝細胞癌や、ウイルス以外が原因の肝細胞癌では、HBxはほとんど見られませんでした。HBVが原因の肝細胞癌では、HBxが多いほど腫瘍が大きい、AFP(肝細胞癌などで高くなりやすい血液中の物質で、腫瘍マーカーとして使われます)が高いという関係が見られました。
YAP(Hippo signalingに関わるタンパク質で、核の中で働くと細胞増殖を促し、細胞死を起こりにくくします)は原因に関係なく比較的よく見られましたが、特にHBVが原因の肝細胞癌の腫瘍で強く出ていました。HBVが原因の19例のうち84%でYAPが見られ、腫瘍のほうが腫瘍周囲より明らかに多くなっていました。HCVが原因の肝細胞癌でも腫瘍でYAPが増えていましたが、HBVが原因の場合ほど強くはありませんでした。ウイルス以外が原因の肝細胞癌ではYAP陽性の例は多いものの、腫瘍と腫瘍周囲の差ははっきりしませんでした。
全体として、YAPが多いほど腫瘍が大きいという関係が見られました。AFPとの関係は「関係がありそうだが決め手は弱い」程度でした。
HBVが原因の腫瘍だけで見ると、HBxとYAPが両方出ている腫瘍が63%で、YAPだけ出ている腫瘍が少数あり、両方出ていない腫瘍もありました。一方で「HBxだけが出ている腫瘍」はありませんでした。臨床的には、両方出ていない腫瘍は、がんの性質が比較的おだやかな傾向があり、PFS(治療後などに、がんが悪化せずに保たれた期間を表す指標です)も良い傾向がありました。両方出ている腫瘍の中では、がんの分化度が低いものほどPFSが短い例が見られました。
また、肝がん細胞でHBxやYAPを多く作らせると、DNA複製(細胞分裂の前にDNAをコピーする過程で、がん細胞ではこの仕組みが活発になりがちです)、細胞周期(細胞が成長して分裂するまでの流れで、乱れるとがん化に関わります)、増殖、がんに関係する仕組みに関わる遺伝子の働きが強まりやすいことが示されました。特にYAPを増やした場合は、HBxを増やした場合よりも、いくつかのがん関連の仕組みがより強く動くことが示されました。

新潟大学病院で集めた、手術で切除された肝細胞癌(肝臓の細胞から発生するがんで、肝がんの中で最も多いタイプです)の検体を使いました。化学療法(薬でがん細胞を攻撃する治療です)や肝動脈化学塞栓療法(肝臓の腫瘍に栄養を送る血管をふさぎつつ、抗がん薬を届ける治療です)を受けたことがない患者が対象です。2012〜2019年に切除されたstage Iの肝細胞癌54例を調べ、HBV(B型肝炎ウイルスのことで、感染が続くと肝炎や肝硬変、肝がんの原因になります)が原因19例、HCV(C型肝炎ウイルスのことで、長期間の感染が肝がんにつながることがあります)が原因17例、ウイルス以外が原因19例に分けました。
腫瘍と腫瘍周囲の組織を染色し、HBx(HBVが作るタンパク質で、細胞の増殖やがん化に関わる複数の仕組みに影響しうるとされます)とYAP(Hippo signalingに関わるタンパク質で、核の中で働くと細胞増殖を促し、細胞死を起こりにくくします)がどのくらいあるかを免疫組織化学(特定のタンパク質を抗体で染め分けて、組織の中のどこにどれだけあるかを見る方法です)で調べ、画像解析ソフトで陽性部分の割合を数値化しました。さらに、数値と腫瘍サイズやAFP(肝細胞癌などで高くなりやすい血液中の物質で、腫瘍マーカーとして使われます)の関係を統計的に調べました。
加えて、肝がん細胞株にHBxやYAPを作るプラスミド(細胞に遺伝子を入れて働かせるためのDNAの道具です)を入れて、遺伝子発現の変化を広く調べる解析や、細胞増殖の測定も行いました。

HBV(B型肝炎ウイルスのことで、感染が続くと肝炎や肝硬変、肝がんの原因になります)が原因の肝細胞癌(肝臓の細胞から発生するがんで、肝がんの中で最も多いタイプです)では、HBx(HBVが作るタンパク質で、細胞の増殖やがん化に関わる複数の仕組みに影響しうるとされます)が多いほど腫瘍が大きく、AFP(肝細胞癌などで高くなりやすい血液中の物質で、腫瘍マーカーとして使われます)も高いという関係が見られました。またYAP(Hippo signalingに関わるタンパク質で、核の中で働くと細胞増殖を促し、細胞死を起こりにくくします)は腫瘍周囲より腫瘍で強く増えており、特にHBVが原因の症例で目立っていました。腫瘍の中でHBxとYAPが一緒に見られることは多く、両方が出ている腫瘍は、より悪性度が高い可能性が示されました。
細胞実験の結果も合わせると、HBxとYAPが関わる流れが、細胞の増殖やがんの進行を進める方向に働く可能性があると考えられます。HBVを肝細胞から完全に取り除く治療が確立していない現状では、YAPのような分子が将来の治療標的になるかもしれない、という点に意味があります。

この研究は症例数が多くないことが限界です。また、HBx(HBVが作るタンパク質で、細胞の増殖やがん化に関わる複数の仕組みに影響しうるとされます)がある肝細胞でYAP(Hippo signalingに関わるタンパク質で、核の中で働くと細胞増殖を促し、細胞死を起こりにくくします)が増えることが、体の中で具体的にどう腫瘍の大型化や進行につながるのかは、まだ十分に分かっていません。今後は、single-cell assayのように細胞1個ずつの違いまで調べる方法や、動物など体の中で起きる仕組みを確かめる実験を進める必要があります。YAPを治療標的にする考え方は有望ですが、実際の医療として確立するには、さらに強い証拠が求められます。