長い滞在期から結核を発病し治癒したアジアゾウにおける、抗結核菌蛋白質IgGのモニタリング

ゾウの結核（tuberculosis: TB）は、致死的になり得るうえ、ゾウと人（および他の哺乳類）との間での感染伝播が報告されているため、保全上および公衆衛生上の懸念事項である。診断上の中心的な問題は、ゾウにおける現行のゴールドスタンダードであるtrunk wash cultureとPCRが、主として菌の排出（bacterial shedding）が始まった後の感染を検出する点にあり、これは二次感染の防止という観点では遅すぎる。さらに、ゾウでは胸部画像検査の実施が現実的でないこと、ならびに代替となる免疫学的検査（例：tuberculin skin testing、interferon-gamma release assays）の感度や実施可能性が限られることが、早期検出を一層困難にしている。こうした背景のもと、本研究は、抗原特異的IgGを縦断的に測定することで、(i) 長期潜伏（long-term latency）に整合する長い無症候期に感染を検出できるか、(ii) 疾病の進展と治療反応を追跡する指標を提供できるか、を評価することを目的とした。著者らは、日本で最初のゾウTB治療例について、16年以上にわたり保存されていた凍結血清（cryopreserved sera）を用い、診断の約12年前から治療後フォローアップまでを解析できるようにした。

試験した11種類の抗酸菌タンパク質のうち、ELISAの半定量により、IgGが強く検出されたのは主にESAT6/CFP10、MPB83、Ag85Bであった。縦断プロファイリングでは、抗原ごとに異なる動態が示された。ESAT6/CFP10特異的IgGは2003年11月の時点ですでに高値であり、その後の臨床発症や治療の有無にかかわらず一貫して高いままで、増加も小幅にとどまった（2003年11月から2016年2月で1.1倍）。この安定性から、著者らはESAT6/CFP10が無症候期と症候期の両方にわたり免疫優位（immunodominant）であり、感染検出に有用だと主張した。これに対してAg85B特異的IgGは、2003年11月から2011年7月までは本質的に認められず（PBS対照との差は有意でなし；Wilcoxon signed-rank test p = 0.706）、その後に急増した。具体的には、2003年11月と比べて、2014年2月（発症の約2年前）で11.8倍、治療開始時（2016年2月）で14.4倍となり、治療中／治療後には低下した（2016年2月から2019年12月で0.7倍）。MPB83は中間的な挙動を示し、2003年11月から2016年2月で2.5倍増加し、治療に伴いわずかに低下した（2016年2月から2019年12月で0.9倍）。7頭の健康なアジアゾウの血清を用いた特異性チェックでは、ESAT6/CFP10とAg85BのELISA吸光度はPBSと差がなかった（Tukey test p = 1.000、両者とも）。一方、MPB83の吸光度はPBSより有意に高かった（p = 0.024）。著者らはこれを、この条件下ではMPB83の診断特異性が低下していることを示す所見として解釈した。

本研究では、単一の「TB positive elephant」から2003年11月〜2019年12月に53時点で採取された血清（診断前約12年から治療完了後13か月までを含む）を解析し、加えて陰性対照として、日本で臨床的に健康なアジアゾウ7頭から各1検体の血清を用いた。初期スクリーニングにはDual Path Platform（DPP）VetTB assayを用い、ESAT6/CFP10およびMPB83に対する抗体を検出し、結果は目視で判定した。定量評価のために、著者らは11抗原（陽性対照としてPPDも追加）に対するIgGを測定するELISAを開発した。抗原はESAT6/CFP10、MPB83、Ag85B、HBHA、Acr、MDP1、および追加候補5種（Rv2074、Rv2652c、Rv3878、Rv1507A、Rv3108）である。抗原選定の背景づけとして、感染株の全ゲノムシーケンスデータ（Mtb variant caprae DRR120408およびDRR120409）をH37Rvにマッピングし、遺伝子の有無を評価したところ、Rv2074とRv2652cについては相同遺伝子が欠失していることが示された。組換えタンパク質は標準的なHis-tag法で発現・精製し（いくつかのタンパク質は培養ろ液から精製）、ELISAではrabbit anti-elephant IgGとペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いてゾウIgGを検出し、OD 450 nmで読み取った。統計解析として、健康なゾウにおける抗原特異性の比較にはTukey honestly significant difference testを、早期期間におけるAg85BシグナルとPBS対照の比較にはWilcoxon signed-rank testを用いた。

著者らは、縦断的な血清学的評価（longitudinal serology）が、菌排出の検出に依存する方法よりも、ゾウTBのより早期かつ情報量の多いモニタリングに寄与し得ると結論づけた。これは特に、ゾウでは痰の採取（sputum collection）や画像検査に制約があることを踏まえた主張である。ESAT6/CFP10特異的IgGは観察期間を通じて高値を維持しており、長い無症候期でも検出可能な感染マーカーとしての役割が支持された。2003年11月という早期から検出されたことに基づき、著者らは、臨床診断より12年以上前から感染していたと推論した。これに対し、Ag85B特異的IgGはより後期に出現し、臨床経過と治療に伴って大きく変動したことから、発症予測および治療効果評価の候補マーカーとしてAg85Bを提案した。MPB83については、健康なゾウがDPP陰性であるにもかかわらずELISAでは測定可能なMPB83反応性を示したため、特異性が低いと解釈された。ただしTB症例では、MPB83は診断の数年前から増加し、治療に伴いわずかに低下した。総じて本研究の意義は、治療に成功したゾウにおける、発症前からの稀少な長期凍結血清を活用し、安定した感染指標となる抗原と、疾患活動性や治療反応を反映する可能性のある抗原とを区別できた点にある。

本論文は、この単一の治療例を超えた検証の必要性を強調している。著者らは、Ag85B（および他の抗原特異的IgGの推移）を、発症予測や治療効果判定の信頼できるツールとして確立するには、より多くのゾウでの広範な確認が必要であると明記している。また、ゾウでは他の臨床モニタリング手段、とりわけ胸部画像検査や日常的な細菌学的サンプリングが実施しにくいことから、抗体モニタリングが特に有用になり得るとも述べている。この枠組みのもと、今後は、観察された抗原特異的パターン（安定したESAT6/CFP10、病勢と治療に反応するAg85B、中間的なMPB83）が、異なる感染経過をたどるゾウでも一般化するかを検証し、こうした血清学的マーカーを、菌排出前の検出（pre-shedding detection）や、動物園および保全現場での縦断管理にどのように運用し得るかを明らかにすることが課題となる。さらに著者らは、成功したゾウTB治療例の報告数が限られていることを踏まえ、同様の縦断データセットを蓄積することが、診断のみならずゾウTBの治療薬（elephant TB medicine）の開発にも情報を与え得ることを示唆している。

ゾウの結核(結核菌によって起こる感染症です。肺などに病変を作り、重症化すると命に関わります。ゾウでも発症し、人や他の動物にうつる可能性があるため重要です。)は、ゾウが重い病気になることがあるだけでなく、ゾウから人へ、または人からゾウへうつる可能性もあるため、自然保護や公衆衛生の面で問題になります。
しかし、現在よく使われる検査であるtrunk wash culture(ゾウの鼻の通り道に液体を入れて回収し、そこに結核菌がいるかを培養で調べる方法です。菌を外に出し始めてから陽性になりやすい点が課題です。)やPCR(菌の遺伝子を増やして検出する検査法です。少ない量でも見つけられることがありますが、検体に菌が含まれていないと検出できません。)は、ゾウが結核菌を体の外に出し始めた後に見つかることが多く、見つかった時にはすでに周りへうつす危険が高くなっている点が課題です。さらに、ゾウは体が大きく胸の画像検査をしにくいことや、別の免疫の検査も十分に使いやすいとは言えないことが、早期発見を難しくしています。
そこで本研究は、血液中の「特定の抗原(免疫が「異物」として認識する目印となる物質で、結核菌のタンパク質などが該当します。どの抗原に反応するかで、感染の状態を推測できます。)に反応するIgG(血液中にある抗体の一種です。過去や現在の感染に対する免疫反応を反映することがあり、感染の検出や経過観察に使われます。)」を長期間にわたって測り続けることで、症状がない長い期間でも感染を見つけられるか、また病気の進み方や治療の効き具合を追える指標になるかを確かめることを目的としました。日本で最初に治療に成功したゾウの結核例について、16年以上保存されていた血清を使い、診断より約12年前から治療後までの変化を調べました。

11種類の結核(結核菌によって起こる感染症です。肺などに病変を作り、重症化すると命に関わります。ゾウでも発症し、人や他の動物にうつる可能性があるため重要です。)菌関連タンパク質を調べたところ、特に強くIgG(血液中にある抗体の一種です。過去や現在の感染に対する免疫反応を反映することがあり、感染の検出や経過観察に使われます。)が検出されたのはESAT6/CFP10(結核菌が作る代表的な抗原で、検査でよく使われます。BCGなどには基本的に含まれないため、結核感染を見分けるのに役立つとされています。)、MPB83(結核菌関連の抗原の一つで、検査キットでも使われます。ただし条件によっては健康な個体でも反応が出ることがあり、解釈に注意が必要です。)、Ag85B(結核菌が増える時に関わるタンパク質の一つです。活動性が高まると抗体が増えやすい可能性があり、発症や治療反応の指標として期待されます。)でした。
ESAT6/CFP10に対するIgGは、2003年の時点ですでに高く、その後も発症や治療に関係なく高いままで、大きくは変わりませんでした。このことから、ESAT6/CFP10は症状がない時期でも感染を見つけるのに役立つ可能性が高いと考えられました。
一方、Ag85Bに対するIgGは、初期の長い期間はほとんど見られませんでしたが、発症の少し前から急に増え、治療が進むと減っていきました。つまりAg85Bは、発症が近いことや治療の効果を反映する指標になり得ます。
MPB83はその中間の動きを示しましたが、健康なゾウでもELISA(抗原と抗体の結びつきを利用して、抗体の量を色の変化として測る検査法です。数値で比較しやすく、時間変化の追跡に向いています。)では反応が出ることがあり、この条件では「結核に特有の反応」と言い切りにくい可能性が示されました。

結核(結核菌によって起こる感染症です。肺などに病変を作り、重症化すると命に関わります。ゾウでも発症し、人や他の動物にうつる可能性があるため重要です。)と診断された1頭のアジアゾウから、2003年11月〜2019年12月の間に計53回採取された血清を分析しました。加えて、陰性対照として健康なアジアゾウ7頭の血清を使いました。
最初の確認にはDPP VetTB assay(ゾウの結核スクリーニングに使われる迅速検査キットです。ESAT6/CFP10とMPB83への抗体反応を短時間で確認できます。)を用い、ESAT6/CFP10(結核菌が作る代表的な抗原で、検査でよく使われます。BCGなどには基本的に含まれないため、結核感染を見分けるのに役立つとされています。)とMPB83(結核菌関連の抗原の一つで、検査キットでも使われます。ただし条件によっては健康な個体でも反応が出ることがあり、解釈に注意が必要です。)への抗体を目で見て判定しました。さらに詳しく調べるため、11種類の抗原(免疫が「異物」として認識する目印となる物質で、結核菌のタンパク質などが該当します。どの抗原に反応するかで、感染の状態を推測できます。)（加えて陽性対照としてPPD）に対するIgG(血液中にある抗体の一種です。過去や現在の感染に対する免疫反応を反映することがあり、感染の検出や経過観察に使われます。)を測るELISA(抗原と抗体の結びつきを利用して、抗体の量を色の変化として測る検査法です。数値で比較しやすく、時間変化の追跡に向いています。)を作り、血清中のIgGの強さを数値として比較しました。
また、感染した菌のゲノム情報も調べ、いくつかの候補抗原は感染株では遺伝子が欠けている可能性があることも確認しました。統計的な比較も行い、健康なゾウでの反応の出方や、Ag85B(結核菌が増える時に関わるタンパク質の一つです。活動性が高まると抗体が増えやすい可能性があり、発症や治療反応の指標として期待されます。)が初期に本当に増えていないかなどを検証しました。

血液中の抗体（IgG(血液中にある抗体の一種です。過去や現在の感染に対する免疫反応を反映することがあり、感染の検出や経過観察に使われます。)）を長期的に追う方法は、菌の排出(感染した動物が菌を体の外へ出すことです。周囲への感染が起きやすくなるため、排出が始まる前に見つけることが大切です。)が始まってから見つかりやすい従来法よりも、ゾウ結核(結核菌によって起こる感染症です。肺などに病変を作り、重症化すると命に関わります。ゾウでも発症し、人や他の動物にうつる可能性があるため重要です。)を早い段階から見守るのに役立つ可能性があります。
ESAT6/CFP10(結核菌が作る代表的な抗原で、検査でよく使われます。BCGなどには基本的に含まれないため、結核感染を見分けるのに役立つとされています。)は長期間ずっと高く、症状がない時期でも感染を示す目印になり得ました。実際に2003年の時点で高かったことから、このゾウは診断より12年以上前から感染していた可能性があると考えられました。
Ag85B(結核菌が増える時に関わるタンパク質の一つです。活動性が高まると抗体が増えやすい可能性があり、発症や治療反応の指標として期待されます。)は発症前に増え、治療で下がったため、発症の予測や治療効果の評価に使える候補とされました。MPB83(結核菌関連の抗原の一つで、検査キットでも使われます。ただし条件によっては健康な個体でも反応が出ることがあり、解釈に注意が必要です。)は症例では増加が見られたものの、健康なゾウでも反応が出る場合があり、検査の「結核に特有かどうか」という点では注意が必要とされました。
この研究の大きな価値は、治療に成功したゾウの非常に長期間の保存血清を使い、「感染の有無を安定して示す抗原(免疫が「異物」として認識する目印となる物質で、結核菌のタンパク質などが該当します。どの抗原に反応するかで、感染の状態を推測できます。)」と「病気の勢い・治療反応を示しやすい抗原」を分けて考えられることを示した点です。

今回は1頭だけの詳しい追跡なので、Ag85B(結核菌が増える時に関わるタンパク質の一つです。活動性が高まると抗体が増えやすい可能性があり、発症や治療反応の指標として期待されます。)などの指標が本当に多くのゾウでも同じように使えるか、追加の研究が必要です。
ゾウでは胸の画像検査や痰のような検体採取が難しいため、血液で抗体を追う方法は特に役立つ可能性があります。今後は、ESAT6/CFP10(結核菌が作る代表的な抗原で、検査でよく使われます。BCGなどには基本的に含まれないため、結核感染を見分けるのに役立つとされています。)が安定して高いこと、Ag85Bが病気の進行や治療に反応すること、MPB83(結核菌関連の抗原の一つで、検査キットでも使われます。ただし条件によっては健康な個体でも反応が出ることがあり、解釈に注意が必要です。)が中間的であること、といったパターンが他のゾウでも当てはまるかを確かめ、菌を排出する前に見つける方法として現場でどう運用するかが課題になります。さらに、治療に成功した例のデータを増やすことは、診断だけでなく、ゾウの結核(結核菌によって起こる感染症です。肺などに病変を作り、重症化すると命に関わります。ゾウでも発症し、人や他の動物にうつる可能性があるため重要です。)治療薬の開発にも役立つ可能性があります。