硬膜下血腫における皮質動脈微小破裂の検出と形態解析 : CUBIC法による組織透明化を用いた3次元画像化

急性硬膜下血腫（subdural hematoma: SDH）は通常、重度の頭部外傷によって生じる脳挫傷や架橋静脈の破綻に起因するとされるが、軽微な出来事、あるいは「非外傷性／自然発生（nontraumatic/spontaneous）」の状況の後にもSDHが起こり得る。後者の状況では皮質動脈（cortical artery）の破裂が出血源として認識されているものの、その病態形成（pathogenesis）は病理学的観点から十分に確立されていない。49編の出版物で198例が報告されている一方、剖検に基づく詳細な組織病理学的検査が行われたのは2編の出版物における8例のみであり、これは主として、皮質動脈破裂が肉眼的に見落とされやすく、標的とする顕微鏡観察のために局在を特定しにくいことによる。従来の組織学的確認には数百〜数千枚の連続切片が必要となる場合があり、検出と形態学的特徴づけが非効率で、ときに現実的でない。そこで本研究は、clear, unobstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis（CUBIC）の組織透明化法をlight-sheet fluorescence microscopy（LSFM）と組み合わせることで、標準的な肉眼観察および組織病理学と比べて、ヒト皮質動脈の三次元（3D）可視化と、SDHにおける破裂部位の形態学的解析に適するかを評価した。

法医解剖のSDH 6例（64〜95歳；平均86.7歳；男性1例、女性5例）で、組織病理学的に動脈破裂が確認されていた症例を対象に、CUBIC+LSFMは4例で皮質動脈破裂を明瞭に可視化した。症例1〜5では、破裂はシルビウス裂（Sylvian fissure）近傍の皮質動脈から分岐する枝の根部、またはその近傍に位置していた。6例中5例では、破裂は小さな分岐部（二股分岐）で生じていた。症例5では、破裂部位がCUBICの撮像範囲外にあったため評価できなかった。症例6では、局所的な挫傷に関連する皮質下血腫（subcortical hematoma）が、微小な動脈裂傷のLSFMによる可視化を妨げた。また組織病理学では、出血源が硬膜（dura mater）内の架橋動脈（bridging artery）の断裂であることも示され、他症例で見られた「分岐根部（bifurcation-root）パターン」とは異なっていた。拡大した肉眼観察と比較すると、CUBICは、表面の出血が血管を覆い隠していた場合（症例3）や、肉眼的所見が認められなかった場合（症例1および4）に破裂検出を改善した。さらにCUBICは、1本の皮質動脈に2か所の破裂がある（症例3）といった複雑病変を統合した3D描出として示し、通常は別々の組織切片に分散してしまう複数の破裂端同士の関係を一つの像にまとめることができた。透明化後の組織学的検討は概ね解釈可能であったが、小さな脳実質（parenchymal）の亀裂がときに観察された。

著者らは後ろ向きに、所属機関において2017〜2019年に法医解剖で、皮質動脈破裂が組織病理学的に検出されていたSDH 6例すべてを選択した。破裂候補領域を局在化するため、既報のプロトコルに従い、死後CT angiographyおよび分離した脳への動脈内液体灌流（intra-arterial fluid perfusion）を行った。その後、疑われる病変を含むホルマリン固定済みの直方体の脳ブロック（26–55 mm × 18–50 mm × 12–26 mm）を切り出し、サンプリング前後に拡大肉眼写真を取得した。組織透明化には水系のCUBIC試薬を用い、脱色／脱脂にはCUBIC-L（10 wt% N-butyldiethanolamine, 10 wt% Triton X-100）、屈折率整合にはCUBIC-R（45 wt% antipyrine, 30 wt% nicotinamide；pH 8–9をN-butyldiethanolamineで調整）を用いた。ブロックはPBSで洗浄（6 h）後、45 °CでCUBIC-Lに12日間浸漬し（試薬交換1回）、再度洗浄してから、LSFM前にCUBIC-Rへ3日間浸漬した。LSFMはMVX10-LSシステムを用い、対物0.63×（NA 0.15；作動距離87 mm）、532 nmおよび637 nmレーザー、z-stack 5–10-μmで撮像し、試料は油混合液（RI = 1.525）に浸漬した。撮像後、試料をPBSで洗浄し、パラフィン包埋して連続切片を作製し、Elastica van Gieson染色で組織病理学的確認を行った。計算解析にはImaris（version 9.5.1）を用い、LSFMデータから3Dレンダリングおよび断面画像を作成し、肉眼所見および組織所見と直接比較した。

本研究は、CUBIC組織透明化とLSFMの組み合わせにより、多くの症例で皮質動脈破裂を2Dおよび3Dで可視化でき、その構造的詳細は組織病理学に匹敵するレベルである一方、微細あるいは遮蔽された破裂部位の検出では肉眼観察を上回ると結論づけた。主な付加価値は、非破壊的な3D再構築にある。すなわちCUBICは、出血性沈着物が血管を覆い隠す状況でも小枝や破裂形態を明らかにでき、複数の破裂部位の空間関係を一つの整合的なビューに統合できる。これは従来の組織学では、広範な連続切片作製を行わない限り、断片化した2D切片としてしか得られない情報である。著者らはまた、CUBIC撮像はその後の標準的な組織病理学的検査を妨げないことを強調しつつ、CUBIC由来の断面では微細構造を見落とし得る（症例2）こと、さらに機序／病因（mechanistic/pathogenetic）の評価は画像のみではなく特殊染色に依存することが多いため、組織病理学は依然として必要であると述べている。実務上の限界として、血腫が透明化に抵抗して隣接する微細構造を覆い隠す場合がある（症例6）こと、透明化後の組織が機械的に脆くなること、透明性や光の減衰（optical attenuation）により撮像が制約され、病変が単一の撮像ウィンドウ外に位置し得る（症例5）ことが挙げられた。総合すると、本研究はCUBICを、SDHにおける出血源としての動脈破裂の検出感度を高め、形態学的解析を改善し得る補完的手法として位置づけている。

著者らは、本症例シリーズは法医神経病理学におけるCUBICの利点・欠点を十分に特徴づけるには小規模であり、さらなる経験により追加の制約や利点が明らかになる可能性があると述べている。また本研究は、皮質動脈破裂によるSDHの病態形成をまだ説明できておらず、CUBICが機序の解明に最終的にどれほど寄与するかは不確実であることを明確にしている。それでも、動脈構築の3D形態解析に加え、任意の平面で任意の仮想断面（virtual cross-sections）を生成できる能力は、病変部位のより効率的で標的を絞った病理学的検討を促進し、網羅的な連続切片への依存を減らし得るとしている。さらに、ワークフロー（仮想断面の最適化＋追跡の組織学）を、法医学実務に関連する他の血管病変へ広く適用できる可能性にも言及する一方、血腫が多い条件（例：脳内出血（intracerebral hemorrhage）や大量のくも膜下出血（massive subarachnoid hemorrhage））では、血液が十分に透明化されないため撮像が困難になり得ることを認めている。技術面では、試料状態に応じた最適化の必要性として、CUBIC-L（pH~11；45 °C）における脱脂時間と組織脆弱性のバランス、散乱の強い領域におけるCUBIC-Rの屈折率整合（RI = 1.52）の限界管理、将来的にラベリングや免疫染色を組み込む場合の自家蛍光（autofluorescence）／バックグラウンド問題への対応を論じている。最後に、著者らは、SDHの病態形成の解明を目指し、従来法と並行して改良型CUBIC法[62]を新規症例に現在適用していると報告している。

急性硬膜下血腫(脳の表面と硬膜の間に急に血がたまる状態です。強い頭のけがが原因になりやすいですが、軽い出来事やはっきりしたけががなくても起こることがあり、命に関わることもあるため原因の特定が重要です。)は、強い頭のけがで脳が傷ついたり、脳の表面の血管が切れたりして起こることが多いと考えられています。しかし、軽い出来事のあとや、はっきりしたけががないのに起こる場合もあります。そうした場合の出血の原因として、脳の表面を走る動脈が破れることが知られていますが、なぜ破れるのかは、体の組織を詳しく調べる立場からはまだ十分にわかっていません。
これまでの方法では、破れた場所が肉眼では見つけにくく、顕微鏡で確かめるにも非常に多くの薄い切片を作る必要があり、効率が悪いという問題がありました。そこで本研究では、脳の組織を透明にするCUBIC(組織の色や脂肪などを取り除き、光が通りやすくして透明に近い状態にする方法です。水系で比較的扱いやすく、大きめの人の組織でも立体的な観察に使える点が重要です。)という方法と、LSFM(薄い光の面で試料を順に照らしながら撮影し、立体画像を作る顕微鏡法です。広い範囲を比較的速く3Dで撮れるのが特徴です。)という特殊な顕微鏡を組み合わせて、人の脳の動脈を立体的に見えるようにし、硬膜下血腫で動脈が破れた場所を調べるのに役立つかを確かめました。

法医解剖の急性硬膜下血腫(脳の表面と硬膜の間に急に血がたまる状態です。強い頭のけがが原因になりやすいですが、軽い出来事やはっきりしたけががなくても起こることがあり、命に関わることもあるため原因の特定が重要です。)6例を調べたところ、CUBIC(組織の色や脂肪などを取り除き、光が通りやすくして透明に近い状態にする方法です。水系で比較的扱いやすく、大きめの人の組織でも立体的な観察に使える点が重要です。)とLSFM(薄い光の面で試料を順に照らしながら撮影し、立体画像を作る顕微鏡法です。広い範囲を比較的速く3Dで撮れるのが特徴です。)の組み合わせで、4例は皮質動脈(脳の表面（大脳皮質）を走る動脈です。ここが破れると硬膜下血腫の出血源になることがあり、どこでどう破れるかを調べることが病態理解につながります。)の破れた場所をはっきり立体的に確認できました。多くの症例では、シルビウス裂(脳の側面にある大きな溝で、重要な血管が近くを走ります。破れが起きやすい場所の目安として使われます。)の近くにある皮質動脈から出る小さな枝の「分かれ目の根元」付近で破れていました。6例中5例では、血管が二つに分かれる小さな分岐部で破れていました。
一方で、評価できなかった例もありました。1例は破れた場所が撮影できる範囲の外にあり、別の1例は血腫（血のかたまり）が邪魔になって、非常に小さな裂け目が見えにくくなりました。またその例では、別の種類の血管（硬膜側の架橋動脈(硬膜側と脳側をつなぐ血管の一種です。ここが切れると出血の原因になり、皮質動脈の破れとは違うタイプの出血になります。)）が切れていることも示され、ほかの例と違うパターンでした。
CUBICは、表面の出血で血管が隠れていた場合や、肉眼では異常が見えなかった場合でも、破れを見つけやすくしました。さらに、1本の動脈に破れが2か所あるような複雑なケースでも、複数の破れの位置関係を1つの立体像としてまとめて示せました。透明化した後でも、基本的に通常の病理検査は可能でしたが、脳の組織に小さなひびのような変化が見られることもありました。

研究者は、2017〜2019年に行われた法医解剖の中から、顕微鏡で皮質動脈(脳の表面（大脳皮質）を走る動脈です。ここが破れると硬膜下血腫の出血源になることがあり、どこでどう破れるかを調べることが病態理解につながります。)の破れが確認されていた急性硬膜下血腫(脳の表面と硬膜の間に急に血がたまる状態です。強い頭のけがが原因になりやすいですが、軽い出来事やはっきりしたけががなくても起こることがあり、命に関わることもあるため原因の特定が重要です。)6例を選びました。まず、死後CT血管撮影(亡くなった後に、造影剤などを使ってCTで血管の状態を写す方法です。出血源の候補を探すのに役立ちます。)と、脳の動脈に液体を流す方法で、破れが疑われる場所を絞り込みました。その部分を含む脳のブロックを切り出して写真を撮り、CUBIC(組織の色や脂肪などを取り除き、光が通りやすくして透明に近い状態にする方法です。水系で比較的扱いやすく、大きめの人の組織でも立体的な観察に使える点が重要です。)という水系の薬剤で透明化しました。
透明化したブロックをLSFM(薄い光の面で試料を順に照らしながら撮影し、立体画像を作る顕微鏡法です。広い範囲を比較的速く3Dで撮れるのが特徴です。)で薄くスキャンするように撮影し、得られたデータをコンピュータで3D画像にしました。その後、同じブロックから通常の連続切片(同じ組織を非常に薄く何枚も連続して切り出した標本です。小さな異常を見つけるのに役立ちますが、作業量がとても多くなります。)を作って染色し、顕微鏡での病理結果と直接比べました。

CUBIC(組織の色や脂肪などを取り除き、光が通りやすくして透明に近い状態にする方法です。水系で比較的扱いやすく、大きめの人の組織でも立体的な観察に使える点が重要です。)による組織透明化(組織の内部まで光が届くようにして、外からでも中の構造を観察しやすくする処理です。立体的な観察がしやすくなります。)とLSFM(薄い光の面で試料を順に照らしながら撮影し、立体画像を作る顕微鏡法です。広い範囲を比較的速く3Dで撮れるのが特徴です。)を組み合わせると、多くの症例で皮質動脈(脳の表面（大脳皮質）を走る動脈です。ここが破れると硬膜下血腫の出血源になることがあり、どこでどう破れるかを調べることが病態理解につながります。)の破れを2Dと3Dで確認でき、細かさは病理検査に近いレベルで観察できました。特に、肉眼では見つけにくい小さな破れや、出血で隠れた破れの検出では、肉眼観察より有利でした。
この方法の大きな利点は、組織を壊さずに立体構造として見られることです。複数の破れがある場合でも、位置関係を1つの見やすい像にまとめられます。また、CUBIC撮影をした後でも通常の病理検査を続けられる点も重要です。
ただし、画像だけでは細かい構造を見落とす可能性があり、原因や仕組みを判断するには特殊な染色などの病理検査が必要なことが多いので、病理検査が不要になるわけではありません。さらに、血のかたまりが透明化しにくい場合や、組織がもろくなること、光が弱くなって撮影範囲が限られることなどの制約もありました。

今回の研究は症例数が少ないため、今後もっと多くの例で調べて、利点と欠点をさらに確かめる必要があります。また、皮質動脈(脳の表面（大脳皮質）を走る動脈です。ここが破れると硬膜下血腫の出血源になることがあり、どこでどう破れるかを調べることが病態理解につながります。)がなぜ破れるのかという根本的な仕組みは、まだ説明できていません。
それでも、立体画像から好きな方向の仮想断面(実際に切らなくても、3D画像データから好きな向き・位置で断面図を作ることです。狙うべき場所を決めてから実物の切片を作れるため効率が上がります。)を作れることは、必要な場所を狙って効率よく病理検査を進めるのに役立ち、膨大な連続切片(同じ組織を非常に薄く何枚も連続して切り出した標本です。小さな異常を見つけるのに役立ちますが、作業量がとても多くなります。)に頼る場面を減らせる可能性があります。将来的には、ほかの血管の病気にも応用できるかもしれません。ただし、脳内出血など血が多すぎる状態では、血液が十分に透明化されず撮影が難しくなる可能性があるとされています。