ICRおよびNOD/Shiマウスにおけるカドヘリン23の加齢性難聴アレルによる難聴の重篤度の影響

本論文は、難聴（hearing loss: HL）を、先天性難聴、早期発症難聴、加齢性難聴に対する遺伝的寄与を含む、多因子性で非常に頻度の高い疾患として扱う。実験用マウスでは、自然に存在する遺伝子変異がHLを引き起こすだけでなく、その重症度を修飾することもあり、マウス系統はHLの発症と進行に対する遺伝的寄与を解明するうえで有用である。多くの系統で特に影響の大きい修飾因子として、cadherin 23の加齢性難聴アレル（Cdh23ahl）がある。これはスプライス部位の変異（exon 9の最終塩基におけるグアニンからアデニンへの置換）で、exon 9の部分的スキップを引き起こし、より早期かつ重症のHLと関連するが、その機序は未解明である。本研究は、早期にHLを示す2系統、すなわち早期発症の高周波難聴（high-frequency hearing loss: HFHL）を呈するoutbredのJcl:ICR（ICR）系統と、ICR由来で1型糖尿病モデルとして用いられ、生後1か月までに全周波数で重度のHLを示すinbredのNOD/ShiJcl（NOD/Shi）系統において、Cdh23ahlがHL重症度にどの程度強く寄与するかを検証することを目的とした。著者らは、ゲノム編集によりCdh23ahlを野生型アレル（Cdh23+）へ戻すことで、各系統のHLがどの程度Cdh23ahlで説明できるかを明らかにし、各遺伝的背景に追加のリスクアレルが存在する可能性を推定しようとした。

ICRマウスでは、生後1か月時点の聴性脳幹反応（auditory brainstem response: ABR）閾値が4–16 kHzで個体間のばらつきが大きく（正常から重度HLまで）、一方で32 kHzの閾値は不均衡に上昇し、加齢とともに悪化した。具体的には、生後4か月までに全個体が70 dBを超え、生後6か月までに全個体が90 dBを超えた。ゲノム編集によりICR-Cdh23+/+マウスを作製すると、これらの表現型は改善し、ABR閾値のばらつきが小さくなり、32 kHzで閾値が低下した。ABR波形の振幅（波I–V）は全周波数で増加し、特にABR波Iの振幅は全周波数で未編集ICRマウスより有意に高く、95%信頼区間も重ならなかった。歪成分耳音響放射（distortion product otoacoustic emissions: DPOAEs）はICRマウスで低くかつ変動が大きく、生後1か月の多くで32 kHzがノイズフロア付近に達し、生後4か月までに検出不能となった。他の周波数でも生後4–6か月でノイズフロア付近に近づいた。これらのDPOAE低下はICR-Cdh23+/+マウスで広く改善し、生後6か月まで安定したDPOAEが維持された。これと対応して、ICRマウスの有毛細胞病理は加齢とともに進行し、生後6か月では外有毛細胞（outer hair cell: OHC）の欠失が各領域でみられ、生後2か月と比べてOHCが16 kHz領域で67%、32 kHz領域で31%有意に減少したのに対し、ICR-Cdh23+/+マウスでは有毛細胞の欠失が救済された。

NOD/Shiマウスでは、早期のHLが著しく重かった。生後1–2か月で、ABR閾値の中央値は（8 kHzを除き）多くの周波数で100 dB SPLであり、DPOAEピークは本質的に同定できずノイズフロア付近で、ABR波形は概ね平坦で、8 kHzにおける波I振幅の最大値は0.31 μVであった。Cdh23ahlをCdh23+に編集すると、全周波数でABR閾値は有意に低下したが、改善は不完全で、ばらつきも大きかった。特に高周波の聴力は重度障害のままであり、32 kHzではNOD/Shi-Cdh23+/+マウスの閾値が生後1–2か月で71.2–100 dB SPLと高値にとどまり、32 kHzでの波I振幅中央値は0 μVで、8、22.6、32 kHzのDPOAE振幅もノイズフロア水準のままだった。有毛細胞数の解析では、NOD/Shiマウスで生後1–2か月の時点ですでにOHCと内有毛細胞（inner hair cell: IHC）の欠失がみられ、生後6か月では特に32 kHz近傍でOHCがほぼ消失するなど、著しい変性が認められた。編集により4–16 kHz領域の有毛細胞欠失は救済されたが、32 kHz領域は救済されなかった。さらにIHCの異常として、円形の変形や、異常なstereocilia伸長と解釈されたphalloidinシグナルが観察された。両系統を通して、性差は一般に検出されないか小さく、事後検定でも一貫して支持されなかった。

著者らはCRISPR/Cas9を介したゲノム編集により、2つのマウス背景（ICRおよびNOD/Shi）でCdh23ahlアレルを野生型の塩基状態（c.753A>G）へ変換した。protospacer-adjacent motifを含むCdh23配列を標的とするsingle-guide RNAを設計し、T7プロモーターを持つPCR産物テンプレートからin vitro transcriptionによりsgRNAを作製した。相同組換え修復のためにsingle-stranded donor oligonucleotides（ssODNs）を供給し、ICRにはssODN2、NOD/ShiにはssODN1を用いた。導入法は系統で異なり、ICRでは胚へのエレクトロポレーション、NOD/Shiではマイクロインジェクションを行い、生存胚を偽妊娠レシピエントへ移植した。創始個体はブリーダー由来マウスに戻し交配し、その後に交配して遺伝子型が確定した個体群を確立した。遺伝子型判定にはサンガーシーケンシングと、MspI消化を用いたPCR制限断片長多型解析を用いた。

聴機能は、麻酔下の雌雄マウスの左耳でABRおよびDPOAE測定により評価した。ABR閾値は4、8、16、32 kHzで複数の月齢にて測定し（ICR：1、4、6か月；NOD/Shi：1、2か月、および編集個体では最大6か月まで）、ABR波I振幅も定量した。DPOAE振幅はf2周波数にわたり記録し、ノイズフロア付近の値をOHC機能不良の指標として重視した。蝸牛病理は、anti-myosin VI（MYO6）およびphalloidin染色によるwhole-mount免疫組織化学、共焦点イメージング、ならびに4、8、16、32 kHzに対応する蝸牛領域におけるMYO6陽性およびphalloidin陽性のIHC/OHCの手動カウントで評価した。データは個々の散布点として示し、中央値と95%信頼区間を併記した。統計解析はGraphPad Prism 9.5.1で、二元配置ANOVAとSidakまたはTukeyの多重比較を用いて実施した。すべての手技は機関の動物倫理承認（複数の承認番号を記載）に基づいて行われた。

本研究は、Cdh23ahlアレルがICRおよびNOD/Shiの両系統における早期かつ重度のHL表現型に大きく寄与する一方、その影響は遺伝的背景に強く依存する、と結論づけた。ICRマウスでは、Cdh23ahlをCdh23+へ変換することで聴覚表現型が概ね安定化し、全周波数でABR閾値と波I振幅が改善し、DPOAEが経時的に保持され、感覚有毛細胞の加齢進行性の喪失が防がれた。著者らはこのパターンを、ICR背景にあるHLリスクアレルの効果はCdh23ahlとの相互作用がない限り比較的弱いことを示す証拠と解釈し、ホモ接合のCdh23ahlが早期発症HLに必須である他系統で観察される加算的または相互作用的な遺伝構築と整合的だと述べている。対照的にNOD/Shiでは、編集後に閾値が統計学的に有意に低下したものの、重度の高周波機能障害（特に32 kHz）と構造的病理が持続し、32 kHz領域の有毛細胞が救済されないことやstereocilia異常の所見も残った。これらは、NOD/ShiがCdh23ahlとは独立に重度HFHLを駆動しうる追加の強力なHLリスクアレル（複数の可能性も含む）を保有することを支持する。本研究の意義は、広く分布する修飾アレル（Cdh23ahl）の寄与を系統特異的遺伝因子から実験的に切り分け、Cdh23ahlの修正がある背景（ICR）では聴力を大きく改善し得る一方、別の背景（NOD/Shi）では十分ではないことを示した点にあり、これら系統をHLモデルとして解釈・利用する際の精度を高める。

著者らは、HLの基盤となる追加の遺伝因子、特にCdh23補正後も重度の高周波障害が残るNOD/Shi特異的因子の同定が、次の重要なステップだと主張する。NOD/Shiは、ICR由来の祖先性を通じて共有されるHFHLリスクアレルに加え、NOD/Shi特異的なHLリスクアレルをさらに持ち、加算的効果を生む可能性があると提案している。この多アレル性の構築への候補としてAhl2座位が挙げられ、関与するAhl2アレル（複数の可能性）の解明がNOD/ShiマウスにおけるHL機序の説明に中心的となり得るとしている。また、編集済みのinbredであるNOD/Shi-Cdh23+/+マウスでも予想外に大きな個体差がみられ、他の変異が表現型の発現度（expressivity）を修飾している可能性が示唆された。候補の1つとして、ICRとNOD/Shiで共有され自己免疫表現型で知られる主要組織適合性複合体クラスIIのH2g7変異が挙げられ、著者らはアレル編集により聴力の個体差への関与を評価できると示している。最後に、NOD/Shiおよび編集済みNOD/Shiマウスでは、聴力低下が明らかな有毛細胞喪失に先行しているように見え、かつstereocilia異常が観察されたことから、この背景ではstereociliaの変性が主要な病理学的駆動因子である可能性があるとし、後期の有毛細胞枯渇のみを対象とするのではなく、蝸牛の微細構造の早期機能障害を標的とする今後の研究を動機づけるとしている。

この研究では、難聴(音が聞こえにくくなる状態です。生まれつきの場合もあれば、年齢、騒音、薬、感染などで起こる場合もあります。原因が複数重なることも多く、どの要因がどれだけ効くかを調べることが予防や治療につながります。)は「原因が1つではなく、いくつもの要因が重なって起こる、よくある病気」として扱っています。特に、マウスでは生まれつきの遺伝子の違いが難聴を起こしたり、難聴の重さを変えたりするため、難聴の仕組みを調べるのに役立ちます。
多くのマウス系統で難聴に強く関わる遺伝子の型として、Cdh23(内耳で音を感じる細胞のはたらきに関わる遺伝子です。この遺伝子の違いがあると、聞こえの低下が起こりやすくなることが知られています。)という遺伝子のCdh23ahlというタイプが知られています。これは遺伝子の読み取り方に影響する変化で、難聴が早く始まり、重くなりやすいことと関係しますが、なぜそうなるかはよく分かっていません。
そこで研究者は、難聴が早く出る2種類のマウス（ICRとNOD/Shi）を使い、Cdh23ahlが難聴の重さにどれくらい強く関わるのかを確かめました。具体的には、ゲノム編集(生物のDNA配列を狙った場所で変える技術です。原因候補の変異を「直す」ことで、その変異が症状の原因かどうかをはっきり調べられます。)でCdh23ahlを正常型のCdh23+に戻し、それだけで難聴がどこまで説明できるのか、また他にも難聴を強める遺伝子がありそうかを調べました。

ICRマウスでは、生後1か月の時点で聞こえの検査結果に個体差が大きく、軽い個体から重い個体までいました。ただし高い音（特に32 kHz）は早くから悪くなり、月齢が進むほど全体的に悪化しました。
Cdh23(内耳で音を感じる細胞のはたらきに関わる遺伝子です。この遺伝子の違いがあると、聞こえの低下が起こりやすくなることが知られています。)ahlをCdh23+に戻したICR-Cdh23+/+では、聞こえの悪さや個体差が小さくなり、高い音の聞こえも改善しました。耳の機能をみる別の検査でも改善が広く見られ、年齢とともに進む有毛細胞(内耳で音の振動を電気信号に変える細胞です。これが減ったり壊れたりすると、聞こえが悪くなり、回復しにくいことが多いです。)の減少も大きく抑えられました。

NOD/Shiマウスでは、生後1〜2か月という早い時期から、ほとんどの周波数で非常に重い難聴(音が聞こえにくくなる状態です。生まれつきの場合もあれば、年齢、騒音、薬、感染などで起こる場合もあります。原因が複数重なることも多く、どの要因がどれだけ効くかを調べることが予防や治療につながります。)でした。
Cdh23ahlをCdh23+に戻すと、聞こえの検査値は全体として改善しましたが、改善は十分ではなく、特に高い音（32 kHz）は重い障害が残りました。耳の細胞を調べても、4〜16 kHzの領域では細胞の減少が抑えられた一方、32 kHzに対応する領域では細胞の減少が抑えられませんでした。また、一部の細胞で音を感じる毛（stereocilia(有毛細胞の表面にある、毛のような細い突起です。音の振動を感じ取る最初の部分で、ここが変形したり壊れたりすると、細胞が残っていても聞こえが悪くなることがあります。)）の異常が疑われる所見も見られました。
なお、雌雄の違いは全体として大きくありませんでした。

研究者はCRISPR/Cas9という方法で、ICRとNOD/Shiの2系統それぞれでCdh23(内耳で音を感じる細胞のはたらきに関わる遺伝子です。この遺伝子の違いがあると、聞こえの低下が起こりやすくなることが知られています。)ahlをCdh23+（正常型）に戻すゲノム編集(生物のDNA配列を狙った場所で変える技術です。原因候補の変異を「直す」ことで、その変異が症状の原因かどうかをはっきり調べられます。)を行いました。系統によって、受精卵への入れ方（電気を使う方法、注射で入れる方法）が異なります。編集できたかどうかはDNA配列を読む検査などで確認しました。
聞こえの評価は、麻酔をしたマウスの左耳で行い、ABR(音に対する脳の反応を電気信号として記録し、聞こえを客観的に評価する検査です。小さな動物や乳幼児など、本人の返事に頼れない場合にも使える重要な方法です。)とDPOAE(内耳の外有毛細胞が正常に働くときに出る微弱な音を測る検査です。DPOAEが小さい、または測れない場合、外有毛細胞の機能低下が疑われます。)という検査で測定しました。さらに、耳の中の蝸牛(内耳にある、音を感じ取るための器官です。場所によって担当する音の高さが違い、高い音は一部の領域で処理されます。)を取り出して染色し、内有毛細胞(音の情報を神経へ伝える中心的な有毛細胞です。内有毛細胞が障害されると、音を神経信号に変える力が落ち、聴力低下につながります。)と外有毛細胞(音を増幅して小さな音を聞き取りやすくする役割がある有毛細胞です。ここが弱るとDPOAEが低下し、特に高い音から聞こえにくくなりやすいです。)の数を周波数ごとの場所に分けて数えました。結果は個体ごとのデータも示し、統計解析で差が確かなものかを調べました。

この研究は、Cdh23(内耳で音を感じる細胞のはたらきに関わる遺伝子です。この遺伝子の違いがあると、聞こえの低下が起こりやすくなることが知られています。)ahlがICRとNOD/Shiのどちらでも早期で重い難聴(音が聞こえにくくなる状態です。生まれつきの場合もあれば、年齢、騒音、薬、感染などで起こる場合もあります。原因が複数重なることも多く、どの要因がどれだけ効くかを調べることが予防や治療につながります。)に大きく関わる一方で、その影響の出方は「その系統がもともと持つ他の遺伝子の組み合わせ」に強く左右されると結論づけました。
ICRではCdh23ahlを直すことで、聞こえの悪化や細胞の減少がかなり抑えられ、Cdh23ahlの影響がとても大きいことが示されました。
一方NOD/Shiでは、Cdh23ahlを直しても高い音の重い難聴や細胞の異常が残ったため、Cdh23ahlとは別に、強い難聴リスクとなる遺伝子が存在する可能性が高いと考えられます。
この成果は、同じ遺伝子変化でも系統によって効き方が違うことを実験的に示し、これらのマウスを難聴モデルとして使うときの解釈をより正確にする点で重要です。

今後は、特にNOD/ShiでCdh23(内耳で音を感じる細胞のはたらきに関わる遺伝子です。この遺伝子の違いがあると、聞こえの低下が起こりやすくなることが知られています。)を正常に戻しても残る「高い音の重い難聴(音が聞こえにくくなる状態です。生まれつきの場合もあれば、年齢、騒音、薬、感染などで起こる場合もあります。原因が複数重なることも多く、どの要因がどれだけ効くかを調べることが予防や治療につながります。)」を引き起こす追加の遺伝因子を見つけることが重要だとされています。候補としてAhl2という遺伝子領域が挙げられており、複数のリスク遺伝子が足し算のように重なって難聴を強めている可能性が考えられます。
また、遺伝的にそろっているはずのNOD/Shi-Cdh23+/+でも個体差が大きかったため、別の遺伝子が難聴の出やすさを調整している可能性もあります。候補の1つとして、免疫に関係するH2g7変異(NOD系統で自己免疫や1型糖尿病に関係するとされる遺伝子の型です。同じ変異を持つ個体でも症状に差が出ることがあり、難聴の個体差に関わる可能性が議論されています。)が挙げられています。
さらにNOD/Shiでは、有毛細胞(内耳で音の振動を電気信号に変える細胞です。これが減ったり壊れたりすると、聞こえが悪くなり、回復しにくいことが多いです。)が大きく減るより前に聞こえが悪くなっているように見え、stereocilia(有毛細胞の表面にある、毛のような細い突起です。音の振動を感じ取る最初の部分で、ここが変形したり壊れたりすると、細胞が残っていても聞こえが悪くなることがあります。)の異常も見つかったことから、細胞が減る前の「細かい構造の早い段階の故障」に注目した研究が必要だと示されています。