相分離したp62顆粒のULK1によるリン酸化は、酸化還元非依存的なストレス応答を活性化する

液―液相分離（liquid–liquid phase separation：LLPS）によって形成される生体分子コンデンセートは、ストレス応答やタンパク質品質管理など、多様な細胞過程に寄与する。p62 bodiesは、p62がユビキチン化タンパク質とともに形成するLLPS由来のコンデンセートであり、オートファジーによって除去され得る。p62 bodiesは分解・回転（turnover）にとどまらず、NRF2分解を促進するアダプターであるKEAP1を隔離することで、ストレスシグナル伝達も制御する。典型的には、NRF2は酸化剤による（レドックス依存的な）KEAP1修飾によって活性化される。第2の機構であるp62介在性・レドックス非依存的なNRF2活性化は、KEAP1-interacting region（KIR）内のp62 Ser349のリン酸化に依存し、これによりp62–KEAP1結合が強化される。しかし、この経路における主要なキナーゼ、制御の論理、そして生理学的意義は不明であった。本研究は、p62 Ser349リン酸化を担うキナーゼを同定し、このリン酸化がp62 bodies内でどのように機能するか（KEAP1ダイナミクスを含む）を明らかにし、ノックインマウスモデルを用いてin vivoでの影響を検証することを目的とした。

著者らは、ULK1がin vitroおよびin vivoにおけるp62 Ser349リン酸化の主要キナーゼであることを同定し、ULK1がp62に直接結合することを示した。高速原子間力顕微鏡（high-speed atomic force microscopy）により、ULK1（および酵母Atg1）とp62ホモダイマーの間に、intrinsically disordered region（IDR）を介した接触による動的相互作用が観察され、直接的な基質認識と整合した。細胞内でULK1はp62 bodiesに局在し、この局在はFIP200欠損細胞でも持続したことから、ULK1–p62直接相互作用を介したFIP200非依存的リクルートが支持された。ULK1/ULK2の薬理学的阻害（MRT68921またはULK-101）は、p62のSer349およびSer403リン酸化を低下させ、p62 bodiesへのKEAP1集積を減少させ、NRF2標的遺伝子（GCLC、NQO1、UGDH、SOD1、p62を含む）をダウンレギュレートし、ULK活性がレドックス非依存的NRF2活性化と結び付くことを示した。さらに、p62/KEAP1ダブルノックアウト細胞にp62変異体を再導入する系を用い、リン酸化模倣体p62S349Eは、KEAP1流入（FRAP）を実質的に変えない一方で、KEAP1流出（FLIP）を低下させることでp62 bodies内のKEAP1滞留を増加させ、液滴内でのKEAP1移動性も低下させること（t50：8.51 ± 4.83 min、p62S349Aでは3.32 ± 1.23 min）を示した。in vivoでは、ヘテロ接合のリン酸化模倣体p62S351E/+マウス（マウスSer351はヒトSer349に相当）が、持続的なNRF2活性化、KEAP1量の低下、食道および前胃の過角化（hyperkeratosis）、ならびに栄養不良／脱水に関連した重度の成長遅延を示した。一方、リン酸化欠損型p62S351A/S351Aマウスは生存可能で繁殖能もあり、試験した条件下では明らかな表現型を示さなかった。

本研究は、構造／生物物理学的アプローチ、細胞生物学、マウス遺伝学を組み合わせた。ULK1–p62の直接相互作用は、精製した組換えタンパク質を用いた高速原子間力顕微鏡（HS-AFM）により可視化した。具体的には、SNAPタグ付きULK1またはAtg1と、切断p62コンストラクト（268–440 aaおよび320–440 aa）を用い、IDR介在性の一過性結合イベントをリアルタイムで観察した。キナーゼ—基質関係は、精製タンパク質を用いたin vitro kinase assayと、p62 Ser349、Ser403、Ser407に対するリン酸化特異的immunoblottingで検証した。LLPS挙動と液滴へのULK1/Atg1リクルートは、mCherry-p62と直鎖状octaubiquitin（8xUb）で再構成したコンデンセートを用い、共焦点顕微鏡で評価した。また、リン酸化模倣体およびリン酸化欠損体p62変異体を用いて、リン酸化依存的効果を検討した。細胞（Huh-1）では、免疫蛍光でULK1のp62 bodiesへの局在を評価し、p62 bodiesのサイズ／数およびKEAP1集積を定量した。これにはFIP200ノックアウト背景での解析や、外因性GFPタグ付きキナーゼの解析も含まれる。ULK1/ULK2機能は、選択的阻害剤（MRT68921；ULK-101）および一部の実験ではsiRNAによる枯渇で攪乱した。p62 bodiesにおけるKEAP1交換ダイナミクスは、p62/KEAP1ダブルノックアウト細胞に誘導発現型GFP-p62変異体を発現させ、mCherry-KEAP1を一過性に導入した上で、FRAPおよびFLIPで測定した。生理学的検証としてノックインマウスを作製し、p62S351AはCRISPR/Cas9 i-GONADで、p62S351Eはマウス胚性幹細胞でのprime editingの後、キメラ作製と生殖系列伝達により得た。肝臓のNRF2活性は、RNA-seq（STAR/RSEMによるマッピング；差次的発現解析にDESeq2）、qRT-PCR、immunoblotting（核内NRF2を含む）、および関連組織の組織学／IHC解析で評価した。

本研究は、ULK1がp62 Ser349の直接キナーゼであることを確立し、p62の相分離によるp62 bodies内でのULK1活性が、レドックス非依存的NRF2活性化の機械的駆動因子である位置づけを示した。中心的な機能主張は、Ser349リン酸化は主としてKEAP1のp62 bodiesへの流入を増やすのではなく、KEAP1の流出を抑制することで隔離を持続させ、NRF2活性化を可能にする、という点である。さらに、KEAP1結合が強い状況ではp62 bodiesの物性が変化（円形度の低下、液滴内移動性の低下）することと、この分子レベルの滞留効果が結び付けられ、リン酸化依存的なクライアント保持がコンデンセートの挙動を作り替え得ることが示唆された。in vivoのノックインデータは強い生理学的妥当性を与え、リン酸化模倣体p62S351Eの部分的発現だけでKEAP1が不活化され、NRF2シグナルが持続的に上昇し、重篤な病態（特に食道および前胃の過角化が栄養不良につながる）を生じる一方で、リン酸化部位を欠くp62S351Aは、特定病原体不在（specific pathogen-free）条件下では正常な発生と生存に必須ではないことが示された。総合的に著者らは、p62 bodiesとULK1に依存する経路が、生理学的に重要なレドックス非依存的ストレス応答軸を構成すると論じている。

著者らは、本研究から生じた複数の未解決問題を挙げている。ULK1は主としてp62 bodies内でp62 Ser349をリン酸化する可能性が高いが、そのタイミングや、この事象を引き起こす細胞条件は今後明確化する必要がある。また、ULK1が分子レベルでどのようにp62 bodiesを認識するのかについても不確実性があるとして、一過性で弱いIDR介在性相互作用がリクルートの基盤になり得ると提案しつつ、そのような領域では保存配列モチーフの定義が難しい点にも言及している。さらに、強いKEAP1滞留がp62 bodiesを液体様からゲル様状態へ押しやり、オートファジー標的化を有利にする可能性が示唆されるが、これは確定的機構ではなく可能性として位置付けられており、直接的検証が求められる。最後に、加齢に伴いプロテオスタシス系が低下してp62 bodiesが増える可能性があるため、レドックス非依存的なp62介在性NRF2経路は加齢とともに重要性が増すかもしれないとし、老化の過程でこの経路が活性化されるか、また活性化される場合にどの組織で起こるのかを明らかにする将来研究を提案している。

細胞の中では、タンパク質やRNAなどが集まって「液体のしずく」のようなかたまりを作ることがあります。これを液―液相分離(細胞内の分子が水と油のように分かれて集まり、液体のしずくのようなかたまりを作る現象です。細胞の状況に応じて必要な分子を集め、反応を進めたり調節したりするのに役立ちます。)（LLPS）といい、ストレスへの対応や、壊れたタンパク質の処理などに関わります。
p62 bodies(p62とユビキチン化タンパク質が集まってできるコンデンセートです。不要なタンパク質の整理や、特定のタンパク質を閉じ込めることで細胞のストレス応答を調節します。)は、p62(細胞内で不要なタンパク質などを集め、オートファジーへ運びやすくする役割を持つタンパク質です。KEAP1と結びつくことでNRF2の働きにも影響します。)というタンパク質が、ユビキチン化されたタンパク質と一緒に集まってできる「しずく状のかたまり」で、オートファジー(細胞が自分の中の不要物や壊れた部品を袋で包み、分解して再利用する仕組みです。細胞の掃除とリサイクルの役割を持ちます。)で分解されることがあります。またp62 bodiesは、KEAP1(NRF2を分解に回すためのアダプター役のタンパク質です。KEAP1が働いているとNRF2は増えにくくなりますが、KEAP1が不活性化されたり隔離されたりするとNRF2が働きやすくなります。)というタンパク質を中に閉じ込めることで、NRF2(ストレス、とくに酸化ストレスから細胞を守る遺伝子群のスイッチを入れる転写因子です。抗酸化に関わる酵素などを増やし、細胞を保護します。)というストレス対策の仕組みも調節します。
ふつうNRF2は、酸化ストレスによってKEAP1が変化することで活性化されます。一方で、p62のSer349(p62のアミノ酸配列の中で349番目のセリンの位置を指します。ここがリン酸化されるとp62とKEAP1の結合が強まり、NRF2が活性化しやすくなります。)という場所がリン酸化(タンパク質にリン酸基が付く化学変化で、タンパク質の働きや結合相手を変える重要なスイッチになります。)されると、酸化ストレスがなくてもp62がKEAP1と強く結びつき、NRF2が活性化します。ただし、このリン酸化を行う主要なキナーゼ(リン酸化を行う酵素です。特定のタンパク質の特定の場所にリン酸基を付けて、細胞の反応を制御します。)や、細胞内でのしくみ、体の中での重要性はよく分かっていませんでした。
この研究の目的は、p62のSer349をリン酸化する主要なキナーゼを見つけ、そのリン酸化がp62 bodiesの中でKEAP1の動きにどう影響するかを調べ、さらにマウスで体内での影響を確かめることです。

この研究では、ULK1(オートファジー開始に関わるキナーゼで、さまざまな標的タンパク質をリン酸化します。この研究ではp62のSer349をリン酸化する主要因子でした。)がp62(細胞内で不要なタンパク質などを集め、オートファジーへ運びやすくする役割を持つタンパク質です。KEAP1と結びつくことでNRF2の働きにも影響します。)のSer349(p62のアミノ酸配列の中で349番目のセリンの位置を指します。ここがリン酸化されるとp62とKEAP1の結合が強まり、NRF2が活性化しやすくなります。)をリン酸化(タンパク質にリン酸基が付く化学変化で、タンパク質の働きや結合相手を変える重要なスイッチになります。)する主要なキナーゼ(リン酸化を行う酵素です。特定のタンパク質の特定の場所にリン酸基を付けて、細胞の反応を制御します。)であることが、試験管内と生体内の両方で示されました。ULK1はp62に直接結合し、その結合は主に柔らかく形が決まりにくい領域を介した、一時的で動きのある相互作用でした。
細胞内でもULK1はp62 bodies(p62とユビキチン化タンパク質が集まってできるコンデンセートです。不要なタンパク質の整理や、特定のタンパク質を閉じ込めることで細胞のストレス応答を調節します。)に集まり、FIP200(ULK1複合体の一部としてオートファジー開始に関わるタンパク質です。p62と結びつきULK1複合体を運ぶ役割が知られています。)がない細胞でもこの集まり方が保たれたため、ULK1はp62と直接結合してp62 bodiesに来ている可能性が高いと考えられました。
ULK1/ULK2を阻害する薬を使うと、p62のSer349などのリン酸化が減り、p62 bodiesの中にKEAP1(NRF2を分解に回すためのアダプター役のタンパク質です。KEAP1が働いているとNRF2は増えにくくなりますが、KEAP1が不活性化されたり隔離されたりするとNRF2が働きやすくなります。)がたまりにくくなり、NRF2(ストレス、とくに酸化ストレスから細胞を守る遺伝子群のスイッチを入れる転写因子です。抗酸化に関わる酵素などを増やし、細胞を保護します。)が働いた結果として増えるはずの遺伝子の発現が下がりました。つまりULKの働きは、酸化ストレスに頼らないNRF2活性化とつながっていました。
さらに詳しく見ると、Ser349のリン酸化はKEAP1がp62 bodiesに入ってくる量を大きく増やすのではなく、いったん入ったKEAP1が外へ出にくくなることで、p62 bodiesの中に長くとどまらせることが分かりました。その結果、NRF2が活性化しやすくなります。
マウス実験では、Ser349に相当する部位を「リン酸化された状態をまねる変異」にしたマウスは、NRF2が長く活性化し続け、KEAP1量が減り、食道や前胃で角質が厚くなって食べにくくなるなどの重い成長障害が起きました。一方で、リン酸化できない変異のマウスは、調べた条件では大きな異常が見られませんでした。

この研究は、タンパク質の観察・物理的解析、細胞実験、遺伝子改変マウスの解析を組み合わせています。
ULK1(オートファジー開始に関わるキナーゼで、さまざまな標的タンパク質をリン酸化します。この研究ではp62のSer349をリン酸化する主要因子でした。)とp62(細胞内で不要なタンパク質などを集め、オートファジーへ運びやすくする役割を持つタンパク質です。KEAP1と結びつくことでNRF2の働きにも影響します。)が直接結合する様子は、高速原子間力顕微鏡(分子レベルの形や動きを高速で観察できる顕微鏡技術です。タンパク質同士が結合したり離れたりする様子を動画のように捉えられます。)でリアルタイムに観察しました。ULK1がp62のSer349(p62のアミノ酸配列の中で349番目のセリンの位置を指します。ここがリン酸化されるとp62とKEAP1の結合が強まり、NRF2が活性化しやすくなります。)をリン酸化(タンパク質にリン酸基が付く化学変化で、タンパク質の働きや結合相手を変える重要なスイッチになります。)できるかは、精製タンパク質を使った反応実験と、リン酸化を検出する免疫染色法で確かめました。
また、p62とユビキチン化タンパク質(ユビキチンという小さな目印が付けられたタンパク質です。多くの場合「分解して処理するべきタンパク質」という合図になります。)で人工的に「しずく」を作り、ULK1がそこに集まるかを顕微鏡で評価しました。細胞内では免疫蛍光でULK1の局在を調べ、阻害薬や遺伝子操作でULKの働きを弱めたときの変化も測定しました。
KEAP1(NRF2を分解に回すためのアダプター役のタンパク質です。KEAP1が働いているとNRF2は増えにくくなりますが、KEAP1が不活性化されたり隔離されたりするとNRF2が働きやすくなります。)がp62 bodies(p62とユビキチン化タンパク質が集まってできるコンデンセートです。不要なタンパク質の整理や、特定のタンパク質を閉じ込めることで細胞のストレス応答を調節します。)へ出入りする速さは、FRAP(蛍光を一部消してから回復の速さを見る方法で、分子がその場所に入ってくる動きの速さを推定できます。)とFLIP(細胞の広い範囲を繰り返し光で消していき、別の場所の蛍光がどれだけ減るかを見る方法です。分子が外へ出ていく動きのしやすさを推定できます。)という方法で測りました。
さらにマウスでは、Ser351を変異させたノックインマウス(特定の遺伝子に狙った変異を入れて作るマウスです。分子の変化が体全体に与える影響を調べるのに使います。)を作り、RNA-seqやqRT-PCR、タンパク質解析、組織観察でNRF2(ストレス、とくに酸化ストレスから細胞を守る遺伝子群のスイッチを入れる転写因子です。抗酸化に関わる酵素などを増やし、細胞を保護します。)の活性や体への影響を調べました。

この研究は、ULK1(オートファジー開始に関わるキナーゼで、さまざまな標的タンパク質をリン酸化します。この研究ではp62のSer349をリン酸化する主要因子でした。)がp62(細胞内で不要なタンパク質などを集め、オートファジーへ運びやすくする役割を持つタンパク質です。KEAP1と結びつくことでNRF2の働きにも影響します。)のSer349(p62のアミノ酸配列の中で349番目のセリンの位置を指します。ここがリン酸化されるとp62とKEAP1の結合が強まり、NRF2が活性化しやすくなります。)を直接リン酸化(タンパク質にリン酸基が付く化学変化で、タンパク質の働きや結合相手を変える重要なスイッチになります。)する主要因子であることを示し、p62 bodies(p62とユビキチン化タンパク質が集まってできるコンデンセートです。不要なタンパク質の整理や、特定のタンパク質を閉じ込めることで細胞のストレス応答を調節します。)の中で起こるULK1依存的なリン酸化が、酸化ストレスに頼らないNRF2(ストレス、とくに酸化ストレスから細胞を守る遺伝子群のスイッチを入れる転写因子です。抗酸化に関わる酵素などを増やし、細胞を保護します。)活性化を動かす重要な仕組みであると結論づけました。
特に重要なのは、Ser349のリン酸化が「KEAP1(NRF2を分解に回すためのアダプター役のタンパク質です。KEAP1が働いているとNRF2は増えにくくなりますが、KEAP1が不活性化されたり隔離されたりするとNRF2が働きやすくなります。)をより多く呼び込む」のではなく、「KEAP1が外へ出るのを止めて閉じ込め続ける」ことでNRF2を活性化する点です。
また、KEAP1が強く結びついて長くとどまると、p62 bodiesの性質がより固い状態に近づく可能性が示され、コンデンセートの中での分子のとどまり方が、かたまり全体の性質まで変えうることが示唆されました。
マウスで、リン酸化状態をまねる変異が重い病態を引き起こしたことから、この経路が体の中でも強い影響力を持つことが裏づけられました。

今後の課題として、ULK1(オートファジー開始に関わるキナーゼで、さまざまな標的タンパク質をリン酸化します。この研究ではp62のSer349をリン酸化する主要因子でした。)がいつ、どんな細胞の状況でp62 bodies(p62とユビキチン化タンパク質が集まってできるコンデンセートです。不要なタンパク質の整理や、特定のタンパク質を閉じ込めることで細胞のストレス応答を調節します。)内のSer349(p62のアミノ酸配列の中で349番目のセリンの位置を指します。ここがリン酸化されるとp62とKEAP1の結合が強まり、NRF2が活性化しやすくなります。)をリン酸化(タンパク質にリン酸基が付く化学変化で、タンパク質の働きや結合相手を変える重要なスイッチになります。)するのかを明確にする必要があります。またULK1が分子レベルでp62 bodiesをどう見分けて集まるのかも未解決です。
さらに、KEAP1(NRF2を分解に回すためのアダプター役のタンパク質です。KEAP1が働いているとNRF2は増えにくくなりますが、KEAP1が不活性化されたり隔離されたりするとNRF2が働きやすくなります。)が強く閉じ込められることでp62 bodiesが液体状からより固い状態へ変わり、オートファジー(細胞が自分の中の不要物や壊れた部品を袋で包み、分解して再利用する仕組みです。細胞の掃除とリサイクルの役割を持ちます。)で分解されやすくなる可能性が考えられますが、これは今後の直接検証が必要です。
加齢によって細胞のタンパク質管理能力が落ち、p62 bodiesが増える可能性があるため、この酸化ストレスに頼らない経路が老化とともに重要になるか、どの組織で起こるかも今後の研究テーマです。