膀胱癌の細胞保護的オートファジーの標的化がGSK-3β阻害のもたらすアポトーシスと増殖遅延を増強する検討

膀胱がん（bladder cancer: BC）は、その多くを占める尿路上皮がん（urothelial cancer: UC）を中心として、がんによる罹患と死亡の主要な原因であり続けている。特に局所進行または転移性の病態では、多角的治療（multimodality treatment）を行っても転帰が不良である。免疫チェックポイント阻害（例：pembrolizumab）は、特定の状況では化学療法に比べて奏効率を改善したものの、進行BCの全生存期間は依然として非常に低く、新たに、より有効で、場合によってはより費用対効果の高い治療戦略が求められている。著者らは以前、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（glycogen synthase kinase-3β: GSK-3β）をBCの治療標的として提案し、薬理学的なGSK-3β阻害がアポトーシスを増強する一方でオートファジーも誘導し、chloroquineによるオートファジー遮断が抗腫瘍効果を強め得ることを報告していた。しかし、UC細胞においてGSK-3β阻害がオートファジーを誘導する機序は明確になっていなかった。そこで本研究は、(i) BC細胞においてGSK-3β阻害薬が誘導するオートファジーの特徴づけ、(ii) このオートファジーが本状況で生存促進（pro-survival）か細胞傷害性（cytotoxic）かの判定、(iii) TFEBの核移行（nuclear translocation）およびAMPK–ULK1 axisに焦点を当て、関与する制御経路の検討、を目的とした。

複数のUC細胞株（T24、HT1376、RT4）において、GSK-3β阻害薬AR-A014418は、24–72 hの範囲で用量依存的かつ時間依存的に増殖を抑制した。一方、HEK293の正常腎細胞では比較的毒性が低かった。GSK-3β阻害はまた、オートファジーに一致する形態学的変化（細胞質の空胞化およびオートファゴソーム様構造）を引き起こし、LC3Bレベルを増加させた。p62は、より高い阻害薬濃度（25 µM）でこれと反対のパターンを示し、オートファジーの亢進を支持した。GFP-LC3-RFP-LC3∆Gレポーターを用いると、AR-A014418処理後にGFP/RFP比が低下し、オートファジー・フラックス（autophagic flux）の増加と解釈された。siRNAによるGSK-3βの遺伝学的枯渇は、これらのオートファジー関連変化（特にLC3B増加と、T24におけるp62分解）を部分的に再現したが、効果はより弱く、HT1376ではノックダウンも相対的に弱かった。機能的には、chloroquineでオートファジーを阻害すると、いずれか単独の薬剤よりも細胞生存率が有意に低下した（報告されたp値：T24 p = 0.001；HT1376 p = 0.0038；RT4 p = 0.0007；HEK293 p = 0.016）。このことから、GSK-3β阻害によって誘導されるオートファジーは、これらのモデルでは主として細胞保護的（cytoprotective）＝生存促進の応答として働くことが示された。機序として、AR-A014418はTFEBの核内局在を促進し（TFEB-EGFPイメージングで示され、核／細胞質分画でも支持された）。さらに本研究は、AMPK–ULK1経路の関与と整合する変化も同定した。すなわち、p-ULK1はT24およびHT1376で早期に上昇し（3 hでピーク）、p-AMPKαはT24で24 h、HT1376およびRT4で12 hにピークを示して増加した。一方、HEK293ではp-AMPKαは未処理対照で最も高く、処理後に低下した。

著者らは、異なるグレードを代表する3種類のBC/UC細胞株（T24およびHT1376：high grade；RT4：low grade）と、非がん比較としてHEK293細胞を用いてin vitro実験を行った。細胞はGSK-3β阻害薬AR-A014418を、濃度（0–25 µM）および時間（生存率は24、48、72 h；シグナルおよびオートファジーマーカーは追加でより短い間隔）を変えて処理した。補足解析では第2のGSK-3β阻害薬TDZD-8も検討した。細胞生存率／増殖はMTS assayで測定し、490 nmの吸光度を用いた。オートファジー関連変化は、顕微鏡観察（空胞化とオートファゴソーム様構造）およびWestern blottingにより評価し、SQSTM1/p62、Beclin-1、phospho-Beclin-1（S15、S93）、LC3Bを測定し、β-actinをローディングコントロールとした。オートファジー・フラックスはGFP-LC3-RFP-LC3∆Gレポーターシステムで定量し、蛍光顕微鏡とImageJによって、処理12–48 hにおけるGFP/RFP強度比を算出した。TFEBの制御は、TFEB-EGFPを発現させ、Hoechst 33342による核染色を併用した蛍光顕微鏡で核移行を測定し、核／細胞質分画後のWestern blotting（細胞質／核コントロールとしてα-TubulinおよびHistone3）で補完した。特異性の検証として、2種類のsiRNAでGSK-3βをノックダウンし、タンパク質レベルでWestern blottingにより確認した。最後に、阻害薬処理後の時間経過に沿って、AMPKαリン酸化およびULK1リン酸化をWestern blottingで検出し、経路関与を検討した。統計解析はDunnett’s testを伴うone-way ANOVAを用い、データは平均 ± SDで示し、p < 0.05を有意とした。

本研究は、BC細胞におけるGSK-3βの薬理学的阻害が、増殖抑制とオートファジー活性化を同時に引き起こす一方で、誘導されるオートファジーは主として生存促進機構として働き、GSK-3β阻害の細胞傷害性の影響を弱め得る、と結論づけた。重要な点として、chloroquineによるオートファジー遮断は、UC細胞株におけるGSK-3β阻害の致死性を高め、オートファジー阻害によってBC細胞をGSK-3β阻害薬誘導性のアポトーシスおよび増殖抑制に感受性化する、という併用戦略を支持する。機序的には、所見はGSK-3β阻害をTFEBの核移行と結びつけ、さらにオートファジー開始と整合するAMPK/ULK1リン酸化変化とも関連づけた。ただし著者らは、TFEB関連の観察には複雑さ（例：分画アッセイにおけるTFEBタンパク質分布の側面）があることを指摘し、いくつかの点を明確化するには追加実験が必要であると明示している。総じて本研究は、GSK-3β阻害がBC細胞で代償的かつ保護的なオートファジーを誘導するアプローチであることを示し、このオートファジーを標的化することが、ストレス適応的な生存経路に関連する治療抵抗性機構の克服に役立つ可能性があると論じている。

膀胱がん(膀胱にできるがんです。進行すると治療が難しくなり、命に関わることがあります。)は、患者数や死亡数が多いがんの一つで、その多くは尿路上皮がん(尿の通り道の内側を覆う細胞からできるがんで、膀胱がんの大部分を占めます。)という種類です。特に、がんが進んで周りに広がった状態や、別の場所に転移(がん細胞が別の臓器やリンパ節などに移動して増えることです。)した状態では、いくつかの治療を組み合わせても治療成績が良くありません。免疫の薬（例：ペムブロリズマブ(免疫チェックポイント阻害薬の一つで、進行した尿路上皮がんなどに使われます。)）で効く人は増えましたが、それでも進行した膀胱がんの生存率は低く、もっと効果が高い治療法が求められています。
研究グループはこれまでに、GSK-3β(細胞の増殖や生存などに関わる酵素の一つで、がん治療の標的として研究されています。)という細胞内の働きを調整するタンパク質を抑えると、がん細胞が自滅しやすくなる一方で、オートファジー(細胞が不要になった部品を分解して再利用する仕組みで、ストレス下では生き残るために働くことがあります。)という「細胞が自分を守る仕組み」も起きることを報告していました。そして、クロロキン(もともとマラリアの薬ですが、細胞内の分解の最終段階を邪魔してオートファジーを止める目的でも使われます。)でオートファジーを止めると抗がん効果が強くなる可能性も示していました。
そこで本研究では、膀胱がん細胞でGSK-3βを抑えたときに起こるオートファジーの特徴を調べ、そのオートファジーが細胞を助けるのか（生存を助けるのか）、逆に細胞を傷つけるのかを確かめ、さらにTFEB(オートファジーやリソソーム関連の遺伝子の働きをまとめて調整する転写因子で、核に入ると関連遺伝子のスイッチを入れます。)やAMPK(細胞のエネルギーが足りないときに働くセンサーのような酵素で、オートファジーを始める方向に働くことがあります。)とULK1(オートファジーを開始するために重要な酵素で、活性化するとオートファジーが動き出しやすくなります。)という経路が関わるかを調べることを目的にしました。

膀胱がん(膀胱にできるがんです。進行すると治療が難しくなり、命に関わることがあります。)由来の細胞（T24、HT1376、RT4）では、GSK-3β(細胞の増殖や生存などに関わる酵素の一つで、がん治療の標的として研究されています。)を抑える薬AR-A014418によって、薬の量が多いほど、また時間が長いほど細胞の増殖が抑えられました。一方で正常に近い腎臓の細胞（HEK293）では、比較的ダメージが小さめでした。
また、GSK-3βを抑えると、オートファジー(細胞が不要になった部品を分解して再利用する仕組みで、ストレス下では生き残るために働くことがあります。)が起きていると考えられる細胞の見た目の変化が起こり、オートファジーの指標となるLC3B(オートファゴソームの形成と関係するタンパク質で、オートファジーが起きているかを見る目印としてよく使われます。)が増えました。さらに、別の指標であるp62(オートファジーで分解されるタンパク質の一つで、減っていればオートファジーが進んでいる目安になります。)の変化や、蛍光を使った測定から、オートファジーの流れ全体（オートファジー・フラックス）が活発になっていることが示されました。
重要な点として、クロロキン(もともとマラリアの薬ですが、細胞内の分解の最終段階を邪魔してオートファジーを止める目的でも使われます。)でオートファジーを止めると、AR-A014418単独よりも細胞の生存率が大きく下がりました。つまり、この条件で起きるオートファジーは、がん細胞を守って生き残らせる方向に働いている可能性が高いと分かりました。
仕組みとしては、AR-A014418によってTFEB(オートファジーやリソソーム関連の遺伝子の働きをまとめて調整する転写因子で、核に入ると関連遺伝子のスイッチを入れます。)が核の中へ移動しやすくなることが確認されました。また、AMPK(細胞のエネルギーが足りないときに働くセンサーのような酵素で、オートファジーを始める方向に働くことがあります。)やULK1(オートファジーを開始するために重要な酵素で、活性化するとオートファジーが動き出しやすくなります。)の変化も観察され、これらの経路がオートファジーの開始に関わっている可能性が示されました。

膀胱がん(膀胱にできるがんです。進行すると治療が難しくなり、命に関わることがあります。)由来の細胞株(研究のために培養し続けられる細胞の集団で、同じ性質の細胞を繰り返し実験に使えます。)3種類（T24、HT1376、RT4）と、比較のためのHEK293細胞を使い、培養皿の中で実験しました。
AR-A014418をさまざまな濃度と時間で細胞に加え、細胞の増殖や生存率を測定しました。オートファジー(細胞が不要になった部品を分解して再利用する仕組みで、ストレス下では生き残るために働くことがあります。)が起きているかは、顕微鏡での観察や、タンパク質量を調べる方法で評価しました。オートファジーの進み具合は、GFPとRFPという蛍光の比を使う方法で調べました。
さらに、GSK-3β(細胞の増殖や生存などに関わる酵素の一つで、がん治療の標的として研究されています。)そのものを減らすsiRNA(特定の遺伝子の働きを弱めて、そのタンパク質を作らせにくくする短いRNAで、原因の切り分けに使われます。)も使い、薬で抑えたときと似た変化が起こるかを確認しました。TFEB(オートファジーやリソソーム関連の遺伝子の働きをまとめて調整する転写因子で、核に入ると関連遺伝子のスイッチを入れます。)が核に移動するかどうかも蛍光観察と別の検出法で確かめ、AMPK(細胞のエネルギーが足りないときに働くセンサーのような酵素で、オートファジーを始める方向に働くことがあります。)やULK1(オートファジーを開始するために重要な酵素で、活性化するとオートファジーが動き出しやすくなります。)の変化は時間経過に沿って測定しました。

GSK-3β(細胞の増殖や生存などに関わる酵素の一つで、がん治療の標的として研究されています。)を薬で抑えると、膀胱がん(膀胱にできるがんです。進行すると治療が難しくなり、命に関わることがあります。)細胞の増殖は抑えられますが、同時にオートファジー(細胞が不要になった部品を分解して再利用する仕組みで、ストレス下では生き残るために働くことがあります。)も活性化します。そして、そのオートファジーは主に細胞を守る働き（生き残りやすくする働き）をして、治療効果を弱めてしまう可能性があります。
そのため、GSK-3β阻害(あるタンパク質や反応の働きを弱めたり止めたりすることです。)薬に加えて、クロロキン(もともとマラリアの薬ですが、細胞内の分解の最終段階を邪魔してオートファジーを止める目的でも使われます。)などでオートファジーを止める治療を組み合わせると、がん細胞がより死にやすくなり、治療効果を強められる可能性が示されました。
また、TFEB(オートファジーやリソソーム関連の遺伝子の働きをまとめて調整する転写因子で、核に入ると関連遺伝子のスイッチを入れます。)の核への移動やAMPK(細胞のエネルギーが足りないときに働くセンサーのような酵素で、オートファジーを始める方向に働くことがあります。)とULK1(オートファジーを開始するために重要な酵素で、活性化するとオートファジーが動き出しやすくなります。)の変化が関連している可能性が示されましたが、TFEBの結果には解釈が難しい点もあり、追加の実験が必要だと述べられています。