NOTCH2NLCリピート拡張を有する神経核内封入体症患者における遺伝的、臨床的、画像的特徴の異質性

Neuronal intranuclear inclusion disease（NIID）は進行性の神経変性疾患であり、中枢および末梢神経系、ならびに他臓器に好酸性の核内封入体が認められることが病理学的特徴である。臨床的には、認知機能低下、脳炎様エピソード、パーキンソニズム、小脳失調、自律神経障害、筋力低下など多様な症状を呈するため、NIIDの診断は困難である。脳MRIでは、FLAIR/T2-WIで広範な白質病変、DWIでU-fiberに沿った特徴的な高信号がしばしば認められ、NIIDを疑うきっかけになることがあるが、本疾患はいまだ根治不能で、病態形成（pathogenesis）も十分には解明されていない。NOTCH2NLCの5’ UTRにおけるGGCリピート伸長は既知の原因変異であり、特にアジア集団で報告されている。しかし、リピート長やリピート配列の構成がNIIDの多様な表現型とどのように関連するかは不明である。本研究は、NOTCH2NLCリピート伸長を有する日本人NIID患者15例における遺伝学的・臨床的・神経画像的な異質性を記述し、遺伝子型–表現型（genotype–phenotype）関連の可能性を探索することを目的とした。

臨床的にNIIDが疑われた15例全例で、repeat-primed PCRによりNOTCH2NLCのリピート伸長が確認された。Amplicon-length PCRでは、伸長リピートサイズは92 ± 13（範囲: 71–110）と推定されたが、repeat-primed PCRで陽性シグナルがあるにもかかわらず4例では伸長アレルを検出できず、一部症例でサイズ推定に技術的限界があることが示された。Long-read sequencingでは、より広い範囲で、かつより大きい伸長が確認された。すなわち、任意の三塩基配列（trinucleotide sequence）からなる総リピートサイズは138 ± 69（範囲: 94–361）であり、伸長したGGCリピートサイズは114 ± 36（範囲: 44–193）であった。純粋なGGC伸長は1例のみで、多くの症例では追加の三塩基挿入（例: GGA、AGC、GAC）を伴い、3’末端近傍のGGAが高頻度（12/15、80%）であった。伸長したpoly-glycineモチーフ内のnon-glycine型の中断（interruptions）は47%（7/15）に認められた。2例（Pt 7、Pt 14）では両アレル性（biallelic）のリピート伸長がみられ、Pt 14では非常に大きく複雑なアレル（361 repeats）で、モチーフ構成も非典型的であった。臨床的には、これら両アレル性症例はヘテロ接合（heterozygous）症例と比べて明確に異なる表現型を示さなかった。臨床サブタイプでは、認知症優位型と発作性症状優位型が最も多く（各6/15、40%）、自律神経障害優位の特徴を示した1例は既存のサブタイプ分類に当てはまらなかった。MRIでは全例に白質病変が認められ、U-fiberのDWI高信号は14/15（93%）、脳梁（corpus callosum）のFLAIR高信号も14/15（93%）に認められた。小脳萎縮も高頻度（11/15、73%）であった。遺伝子型–表現型解析では、リピート長と発症年齢、MMSE、ARWMCスコアとの間に有意な相関は認められなかった。小脳失調または排尿障害を有する患者では、いずれも非該当患者よりGGCリピートサイズが有意に大きかったが、リピート負荷（repeat burden）を「総三塩基リピートサイズ」と定義した場合、これらの差は有意ではなかった。重要な点として、non-glycine型の中断を持つ患者は、glycineをコードするリピート構成（GGC/GGA/GGG）のみを持つ患者に比べ、ARWMCスコアが高かった。

本研究では、成人発症のleukoencephalopathyに神経学的・認知・精神症状を伴う症例を集めやすくする目的で設計した基準に基づき、6医療機関から15例を登録した（2018年4月～2022年11月）。選択基準は、発症年齢≧20歳、MRI/CTで白質病変を認めること、ならびに関連する臨床症状の存在であった。白質病変が別の原因（脱髄、感染、中毒、腫瘍）に起因する場合、脳梗塞/脳出血の既往がある場合、または白質病変を来す既知変異（CSF1R、NOTCH3、HTRA1）を有する場合は除外した。12例では遺伝学的検査に先立って皮膚生検を行い、生検実施例は全例でp-62陽性の核内封入体が確認された。遺伝学的診断にはrepeat-primed PCR（ノコギリ歯状のelectropherogram pattern）で伸長を検出し、可能な場合には蛍光amplicon-length PCRでサイズ推定を行った。リピート長と配列構成をより正確に定義するため、Oxford Nanopore PromethION（1検体あたり平均96.1 gigabases）を用いたlong-read sequencingを実施し、hg38へのread mapping、アレル特異的コンセンサス構築（CharONT v1.1.0）、Tandem Repeats Finderによるリピート同定を行った。臨床表現型は、標準化された症例報告書と神経内科医による診察に基づき、症状プロファイルを記録し、先行研究の4サブタイプ分類を適用した。全般的認知機能のスクリーニングにはMMSEを用いた。一部症例では、CSFバイオマーカー（Aβ40、Aβ42、Aβ42/40 ratio、t-tau、p-tau181、NfL）を盲検下で重複測定し、規定のカットオフを用いてAT(N)基準で要約した。MRI（1.5または3 tesla）はT1、T2、FLAIR、DWIを含み、2名の神経内科医が匿名化画像を独立に読影し、ARWMCスコアリングにより白質病変負荷を定量化した。統計解析はMann–Whitney U検定とSpearman相関を用い、有意水準はp < 0.05とした。

本研究は、NOTCH2NLCリピート伸長を有するNIID患者が、遺伝学的・臨床的・画像的レベルで顕著な異質性を示すと結論づけた。Long-read sequencingにより、伸長は長さだけでなく（非常に大きく複雑な伸長を含む）配列構成も多様であることが示され、glycineをコードする変異（GGC/GGA/GGG）が頻繁で、さらに約半数の患者ではnon-glycine型三塩基による中断が認められた。臨床的には複数のNIIDサブタイプにまたがり、認知機能低下と発作性の脳炎様エピソードが一般的であった。神経画像では、NIIDに典型的とされる所見（U-fiberのDWI信号と広範な白質病変、脳梁病変を含む）が高頻度にみられ、小脳異常もしばしば認められた。リピート長は発症年齢、認知機能（MMSE）、MRIの総負荷（ARWMC）とは相関しなかった一方で、GGC（またはpoly-glycine）リピートサイズが、総リピート数よりも特定症状（失調、排尿障害）と関連し得ること、またnon-glycine型の中断がより重度の白質変化と関連し得ることを示す限定的な関連が報告された。本研究は、repeat-primedおよびamplicon-length PCRにlong-read sequencingを組み合わせることで診断精度を高め得ること、そして適切な遺伝学的診断の確立が患者管理に重要であることを示した。著者らは、探索的に得られた遺伝子型–表現型のシグナルは研究上の制約を踏まえると確認が必要であると強調している。

著者らは、主として本研究の限界に基づき、将来の研究課題を複数提示している。本研究は横断研究でサンプル数も比較的小さいため、頑健な遺伝子型–表現型推論には検出力が不足している可能性があり、報告された関連（例: GGCリピートサイズと症状の関連、リピート中断とMRI重症度の関連）はより大規模コホートで検証すべきである。また後ろ向き研究デザインのため、臨床像の把握が十分でない、あるいは均一でない可能性があるとして、表現型スペクトラムをより完全に定義するための前向き研究を提唱している。NIIDの自然経過と進行を明確にするため、縦断的データ収集も具体的に提案された。さらに、登録方法がMRIで白質病変を示す患者を集めやすい設計であったため、明確なMRI異常を伴わず筋力低下や末梢神経障害が前面に出るNIIDが過小代表となっている可能性があり、より幅広い症例把握戦略によりこの偏りに対処すべきである。最後に、long-read sequencingにより詳細なサイズ推定と配列特性解析が可能となった一方、NOTCH2NLCのメチル化状態は評価されていない。高い伸長を持つアレルではメチル化がNOTCH2NLC発現に影響し得るとの報告があることから、メチル化解析を統合することが重要な次のステップであると述べている。

NIIDという病気は、ゆっくり進む神経の病気で、脳や神経、さらに他の臓器の細胞の「核」の中に、異常なたんぱく質のかたまりができるのが特徴です。症状は、物忘れや意識がぼんやりする発作のような状態、手足のふるえ、歩きにくさ、体のバランスがとれない、血圧や排尿などを自動で調整する働きの異常、筋力低下など、とても多様です。そのため、症状だけで診断するのは難しいです。
MRI(体を切らずに、強い磁石などを使って体の中を画像で見る検査です。脳の白質の変化などを詳しく調べられます。)ではNIIDを疑う手がかりになる特徴的な所見が出ることがありますが、病気がどうやって起きるのかはまだ十分に分かっておらず、根本的に治す方法もありません。
近年、NOTCH2NLC(NIIDの原因に関わることがある遺伝子の名前です。この遺伝子の特定の場所で繰り返し配列が増えるとNIIDにつながることがあります。)という遺伝子の一部でGGCという短い配列が異常に繰り返し増えることが、NIIDの原因の1つだと分かってきました。ただし、その「繰り返しの長さ」や「配列の組み合わせ」が、症状の違いとどう関係するかははっきりしていません。そこでこの研究では、日本人NIID患者15人について、遺伝子の変化、症状、MRIの特徴がどれくらい人によって違うのかを整理し、遺伝子の違いと症状の違いの関係がありそうかを調べました。

15人全員で、NOTCH2NLC(NIIDの原因に関わることがある遺伝子の名前です。この遺伝子の特定の場所で繰り返し配列が増えるとNIIDにつながることがあります。)の繰り返し配列が増えていることが検査で確認されました。
ただし、PCRという方法で繰り返しの長さを推定しようとすると、陽性反応はあるのに長さを正確に出せない人がいて、この方法には限界があることも分かりました。
一方で、long-read sequencing(長いDNAの読み取りをそのまま行える解析方法で、繰り返し配列の長さや中身の並びをより正確に調べられます。複雑な繰り返しの解析に強いのが利点です。)という詳しい方法を使うと、繰り返しの「全体の長さ」や「中身の配列の組み合わせ」まで、より広い範囲で確認できました。多くの患者ではGGCだけが増えるのではなく、GGAやAGCなど別の3文字配列が途中に入り混じっていました。また約半数で、glycineにならないタイプの配列が途中に入り、繰り返しが「中断」されていました。
2人では、父親由来と母親由来の両方の遺伝子で繰り返しが増えるタイプでしたが、症状が特別に違うとは言い切れませんでした。
症状のタイプ分けでは、物忘れが中心のタイプと、発作のような症状が中心のタイプが多く見られました。
MRI(体を切らずに、強い磁石などを使って体の中を画像で見る検査です。脳の白質の変化などを詳しく調べられます。)では全員に白質の異常があり、多くの人でU-fiber(脳の表面近くで、となり合う脳の領域同士をつなぐ短い神経線維です。NIIDではこのあたりに特徴的なDWIの所見が出やすいとされます。)に沿う特徴的な所見や、脳梁(左右の大脳をつなぐ大きな神経の束です。ここに異常が出ると、MRI所見として診断のヒントになります。)の異常も見られました。小脳が小さくなる変化もよく見られました。
遺伝子と症状の関係を調べると、繰り返しの長さと発症年齢、MMSE(認知機能を簡単に調べるテストで、満点は30点です。点数が低いほど、全体的な認知の低下が疑われます。)、白質変化の強さ（ARWMC）には、はっきりした関係は見つかりませんでした。ただし、体のバランスがとれない症状や排尿の問題がある人では、GGCの繰り返しが大きい傾向がありました。また、glycineにならない配列で「中断」がある人は、MRIでの白質変化が強い傾向がありました。

2018年から2022年にかけて、6つの医療機関で、20歳以上で白質に異常があり、神経・認知・精神の症状がある人を集めて15人を登録しました。別の原因（感染、毒、腫瘍など）で白質が傷んでいる場合や、他のよく知られた遺伝子変化がある場合などは除外しました。
12人では皮膚の一部を調べる検査を行い、特徴的な核内のかたまりが確認されました。
遺伝子検査は、まずrepeat-primed PCR(繰り返し配列が増えているかどうかを見つけるためのPCR検査です。繰り返し増加があると特徴的な結果パターンが出ます。)で繰り返し増加の有無を調べ、可能な場合は別のPCRで長さを推定しました。さらに、より正確に長さと配列を調べるため、Oxford Nanoporeを使ったlong-read sequencing(長いDNAの読み取りをそのまま行える解析方法で、繰り返し配列の長さや中身の並びをより正確に調べられます。複雑な繰り返しの解析に強いのが利点です。)を行いました。
症状は医師の診察と記録に基づいて整理し、認知機能はMMSE(認知機能を簡単に調べるテストで、満点は30点です。点数が低いほど、全体的な認知の低下が疑われます。)で評価しました。MRI(体を切らずに、強い磁石などを使って体の中を画像で見る検査です。脳の白質の変化などを詳しく調べられます。)は複数の撮影法を使い、白質の変化はARWMCスコア(MRIで見える白質の変化の強さを、決められた基準で点数化する方法です。患者さん同士の比較や研究での評価に使われます。)で数値化しました。統計的な比較や相関の検討も行いました。

NOTCH2NLC(NIIDの原因に関わることがある遺伝子の名前です。この遺伝子の特定の場所で繰り返し配列が増えるとNIIDにつながることがあります。)の繰り返し配列が増えたNIIDは、遺伝子の形も、症状も、MRI(体を切らずに、強い磁石などを使って体の中を画像で見る検査です。脳の白質の変化などを詳しく調べられます。)の見え方も、人によって大きく違うことが示されました。long-read sequencing(長いDNAの読み取りをそのまま行える解析方法で、繰り返し配列の長さや中身の並びをより正確に調べられます。複雑な繰り返しの解析に強いのが利点です。)により、繰り返しは長さだけでなく配列の組み合わせも多様で、途中に別の配列が入り込む例も多いことが分かりました。
繰り返しの長さは、発症年齢や認知機能、白質変化の全体的な強さとは単純には結びつきませんでしたが、GGCの大きさや途中の中断が、特定の症状やMRIの重症度と関係する可能性が示されました。
また、PCRだけでは正確に評価できない場合があるため、PCRとlong-read sequencingを組み合わせることで診断の正確さを上げられる可能性があり、適切な遺伝学的診断が患者さんの管理に重要だと示されました。ただし、見つかった関連は少人数での結果なので、今後の確認が必要です。

この研究は人数が少なく、ある時点の状態をまとめた研究なので、遺伝子の違いと症状の違いの関係を強く結論づけるには不十分な可能性があります。今後は、もっと多くの患者さんを集めて、今回示された可能性を確かめる必要があります。
また、情報の集め方が統一されていない部分が出やすい研究方法だったため、症状の全体像をより正確に知るには、最初から計画して追跡する研究が必要です。病気の進み方を理解するために、同じ人を長期間追うデータも重要です。
さらに今回は、MRI(体を切らずに、強い磁石などを使って体の中を画像で見る検査です。脳の白質の変化などを詳しく調べられます。)で白質の異常がある人を集めやすい設計だったので、MRI異常が目立たず筋力低下や末梢神経の症状が中心のNIIDが少なくなっている可能性があります。より幅広い患者さんを対象にする工夫が求められます。
最後に、繰り返しが大きい場合はメチル化(DNAに化学的な印が付くことで、遺伝子の働きやすさが変わる仕組みの1つです。繰り返しが大きい場合に遺伝子の働きが変わる可能性があり、病気との関係が注目されています。)が遺伝子の働きに影響する可能性があるため、今後はメチル化の解析も組み合わせることが重要だとされています。