リンパ系の濾過機能にはリンパ節のミクロあるいはマクロの解剖学的構造が不可欠である

リンパ節（lymph nodes, LNs）はリンパ管に沿って配置され、リンパで運ばれてきた物質を除去すると同時に、免疫監視を支える。リンパ性洞内のマクロファージや、複数のLNが断続的に並ぶ配置（「LN chain」）がリンパのろ過を担うと広く考えられている一方で、著者らは、特定のLN微細構築、マクロファージ亜集団、ならびに同一の排液領域（drainage basin）内にある個々のLNが果たす機能的寄与が、特に定量的な観点から十分に解明されていないと論じる。そこで本研究は、(i) LN内のどこでリンパ由来物質が物理的に捕捉されるのか、(ii) 主なろ過活性を実行する細胞要素はどれか、(iii) 連続するLNが、リンパ由来物質が血流へ到達するのを防ぐために、協調しているか／どのように協調しているか、を明らかにすることを目的とした。SPF条件下で比較的規則的なLN解剖をもつマウスを用い、定常状態および炎症に伴う組織リモデリング後におけるLNろ過の、機序的かつ組織・解剖学的な枠組みの定義に焦点を当てた。

皮下に蛍光トレーサーを投与すると、リンパ由来物質は一定のパターンで、LN内の限局した領域に蓄積した。具体的には、皮質–髄質境界付近のうち髄質側に位置する帯状の領域であった。この現象は、複数の可溶性トレーサー（例：70 kDa Dex-FITC、LPS、OVA）および100 nmビーズで観察された一方、可溶性のfluorescein（Mw 332）では同様の保持が見られなかった。これは、蓄積が蛍光色素の有無ではなく、サイズおよび／または分子特性に依存することを示唆する。組織学的解析により、主たる蓄積部位は、被膜下洞（subcapsular sinus, SS）と髄質洞（medullary sinus, MS）の境界にある特殊な亜領域に局在し、著者らはこれをsubcapsular-medullary sinus border（SMB）と呼んだ。SMBには高密度のreticular lymphatic endothelial cell（rLEC）ネットワークが存在し、CD169+F4/80+の髄質洞マクロファージ（medullary sinus macrophages, MSMs）が集中していた。中隔（septal）のMS内における定量的シグナル勾配は、より上流のマクロファージほど多くのトレーサーを捕捉していることを示し、物理的バリア機能と整合した。

機能的には、clodronate liposomesによるマクロファージ枯渇によりDex-FITCの蓄積はほぼ消失し、LNへの総取り込みは96.2%低下した。また取り込みはMSMsで強く濃縮され（マクロファージ関連シグナルの82.3% ± 1.4%、LN全細胞シグナルの69.6% ± 2.8%）、MSMsが主要な担い手であることが示された。B細胞欠損のμMTマウスでは、SSMsは欠くがMSMsは保持されているが、全体の取り込みと漏出（leakage）表現型はwild-typeと同程度であり、このろ過の読み出し（filtering readout）においてSSMsの役割が最小であることを支持した。SMBはMSMsとLECの一部の両方で強いMARCO発現により特徴づけられ、MARCOはろ過領域を同定する実用的な指標となった。

システムレベルでは、定義された排液経路にある複数LNを解析した結果、LN chain全体で段階的なろ過が起きていることが示された。すなわち、最初の排液LNでトレーサーシグナルが最大となり、下流および別経路のLNでは低下し、ここでもMSMsが支配的な取り込みを示した。血清アッセイでは、LNマクロファージを枯渇させた場合、または末梢LNの大半を欠くマウス（LN-less）では、Dex-FITCの血中への漏出が有意に増加した一方、μMTマウスでは漏出増加が見られなかった。最初の排液LNを選択的に障害（膝窩LNに限定したMSM枯渇）すると、当該LNでの取り込みは低下したが、下流の腸骨LN（iliac LN, iLN）での捕捉が増加し（iLN/poLN比が7.65倍に増加）、血中漏出は増えなかった。これは、下流LNによる代償的ろ過を示す。最後に、CFA誘導性リンパ節腫大（lymphadenopathy）は排液領域（basin）をリモデリングし、SMBの帯状パターンは不明瞭になったものの、膝窩LNでの取り込みは増加（1.49倍）し、別経路での取り込みも増え（特に鼠径LN）、basin全体の取り込みは増加（1.94倍）し、血中漏出は低下（0.51倍）した。これらは、炎症性リモデリングが全体のろ過能力を高めうることを示唆する。

著者らは8–12週齢のマウス（主にC57BL/6JJcl）を用い、加えてμMTマウスおよび、胎内（in utero）でのLTβR-Fc処置により作製した「LN-less」マウスを用いた。可溶性および粒子状の蛍光トレーサーを調製または購入し、70 kDa Dex-FITC、LPS-AF488、OVA-FITC、FITC-zymosan、蛍光latex beads（0.1 μm）、S. aureus-AF594、fluorescein sodium saltを使用した。トレーサーは、排液のマッピングおよびLN chain挙動の定量のため、解剖学的に定義された部位（例：足底、尾基部）へ皮下投与し、複数の体部位に投与する場合と単一部位に限定する場合の両方を行った。投与1時間後にLNを摘出し、臓器全体の蛍光イメージングと、切片ベースの免疫蛍光に供した。

組織構築と細胞局在は、10 μm凍結切片に対し、リンパ球区画、マクロファージ亜集団（CD169、F4/80を含む）、リンパ管内皮（LYVE-1、CD31、podoplaninを含む）のマーカーパネルで染色し、共焦点顕微鏡およびstructured illumination microscopyで評価した。MARCOは切片での解析に加え、whole-mount DAB染色でも検討した。定量は、洞領域に沿った蛍光強度プロファイル作成と、フローサイトメトリーによる定義細胞集団でのトレーサー「取り込み（uptake）」算出を含んだ。総取り込みは「総細胞数 × 集団ごとの平均蛍光強度」として計算し、LN間で集約してbasinレベルの捕捉量を表した。マクロファージ枯渇は、トレーサー投与48時間前に皮下clodronate liposomesを投与して誘導し、広範（複数部位）または局所（膝窩LNを優先的に標的化するため0.3 μg）で行った。炎症によるリモデリングは、後肢足背（hindfoot instep）へのCFA中OVA投与で誘導し、7日後にトレーサーを投与した。血中漏出は、トレーサー投与1時間後に採取した血清を用い、独自のanti-FITC ELISAで定量した。統計解析には対応のないStudent’s t検定、Mann–Whitney U検定、Tukeyの多重比較を伴う一元配置ANOVAを用い、有意水準はp < 0.05とした。

本研究は、LNのリンパろ過が髄質全体にびまん性に分布するのではなく、SMBという離散的な微小解剖学的ユニットに集中していると結論づける。そこではrLECとMSMsが高密度メッシュワークを形成し、物理的捕捉バリアとして働く。検討した条件全体を通じて、MSMsがこの機能の主要な細胞エフェクターとして浮かび上がり、一方SSMsは、本研究で用いたDex-FITCに基づくろ過の読み出しにおいて不要（dispensable）に見える。SMBの顕著なマーカーとして（MSMsとLECの一部に共有される）MARCOを同定したことで、ろ過領域を解剖学的に定義するための操作的手がかりが得られた。より大きなスケールでは、排液領域内の複数LNが、段階的な「LN chain」フィルターとして協調し、リンパ由来物質の血中流入を制限することを、定量的に示した。あるLNのろ過が損なわれると、下流のLNが捕捉を増やして全体の封じ込めを維持しうる。さらに、炎症性リンパ節腫大とそれに伴う経路リモデリングはろ過を弱めるのではなく、basinレベルの捕捉を高め、血中漏出を減らしうる。総合すると、LNろ過は、局所の特殊化したインフラ（SMB）と、臓器レベルでの協調（LN chain）の双方を要する統合システムとして位置づけられ、リンパ循環におけるLNの生理学的な「門番（gatekeeper）」としての役割を明確化する。

リンパ節(リンパ液が流れ込む途中にある小さな器官で、異物をつかまえて取り除き、免疫反応を起こすきっかけを作ります。)は、体の中を流れるリンパ液(血液からしみ出した水分などが集まった体液で、体のすき間の液体や異物成分を運び、最終的に血液へ戻ります。)の通り道にあり、リンパ液にまじった細菌の成分や異物などをつかまえて取り除く場所です。同時に、体を守る免疫が異常を見つけるための「見張り役」もしています。
これまでは、リンパ節の中の「洞(リンパ節の中でリンパ液が流れる空間で、リンパ管内皮細胞によって形づくられます。)（リンパ液が流れるすき間）」にいるマクロファージ(体内のゴミや病原体を食べて分解する免疫細胞で、異物の除去に重要です。)という細胞や、いくつかのリンパ節が列のようにつながる仕組みが、リンパ液をろ過すると考えられてきました。しかし、リンパ節の中のどの場所が中心となってろ過しているのか、どの種類の細胞が主に働くのか、そして複数のリンパ節がどう協力して血液への流入を防ぐのかは、数値でしっかり示された研究が十分ではありませんでした。
そこでこの研究は、マウスを使って、リンパ節のどこで物質がつかまるのか、主役の細胞は何か、複数のリンパ節が協力して血液への流入を防ぐのかを明らかにすることを目的としました。さらに、炎症でリンパ節の形や流れ道が変わったあとに、ろ過のしかたがどう変化するかも調べました。

皮下に光る目印（蛍光トレーサー(体内の流れや取り込みを調べるために使う、光る目印をつけた物質です。)）を注射すると、その物質はリンパ節(リンパ液が流れ込む途中にある小さな器官で、異物をつかまえて取り除き、免疫反応を起こすきっかけを作ります。)のどこにでも広がるのではなく、いつも決まった「帯状の場所」に集まりました。場所は、リンパ節の外側に近い部分から内側へ続く通り道のうち、表面側の洞(リンパ節の中でリンパ液が流れる空間で、リンパ管内皮細胞によって形づくられます。)と髄質(リンパ節の内側寄りの部分で、リンパ液が流れる洞やマクロファージが多く、異物を処理しやすい場所です。)側の洞の境目付近でした。研究者はこの特別な領域をSMB(被膜下洞と髄質洞の境目付近にある特別な領域で、網目構造とマクロファージが集まり、ろ過の中心になります。)と名づけました。
いくつかの大きめの分子や粒（デキストラン(糖がつながった高分子で、サイズを調整しやすく、リンパ節での捕捉の実験によく使われます。)、LPS(細菌の細胞壁成分で、免疫を強く刺激する物質として実験に使われます。)、タンパク質、100 nmビーズなど）はSMBに集まりましたが、非常に小さい分子（fluorescein）は同じようには止まりませんでした。つまり「光る色がついているから止まる」のではなく、主に大きさや性質によってつかまりやすさが変わると考えられました。

SMBを詳しく見ると、網目状の構造を作るリンパ管(リンパ液を運ぶ管で、体中に広がり、途中でリンパ節につながります。)内皮細胞が多く、そこに髄質洞マクロファージ(体内のゴミや病原体を食べて分解する免疫細胞で、異物の除去に重要です。)が集まっていました。さらに、洞の上流ほどトレーサーを多くつかまえていることが数量的に示され、SMBが物理的なバリアとして働くことと合っていました。
実際にマクロファージを減らす処置をすると、トレーサーのたまり方はほぼ消え、リンパ節への取り込み量も大きく下がりました。また、取り込みの多くが髄質洞マクロファージに集中しており、この細胞がろ過の主役であることが示されました。
一方、B細胞がいないマウス（その結果、表面側の洞のマクロファージ(被膜下洞にいるマクロファージで、抗原をB細胞反応につなげる役割が知られますが、本研究の指標では主役ではありませんでした。)が欠ける）でも、ろ過の結果は普通のマウスとほぼ同じでした。つまり、この実験条件では表面側の洞のマクロファージの役割は小さいと考えられました。

さらに、リンパ節が1つだけで働くのではなく、同じ領域からリンパ液(血液からしみ出した水分などが集まった体液で、体のすき間の液体や異物成分を運び、最終的に血液へ戻ります。)を集める複数のリンパ節が「段階的に」ろ過することが示されました。最初のリンパ節でトレーサーが最も多くつかまり、下流のリンパ節ほど少なくなりました。
血液中への漏れを調べると、マクロファージを減らした場合やリンパ節がほとんどないマウスでは、トレーサーが血液へ漏れやすくなりました。しかし、表面側の洞のマクロファージが欠けるマウスでは、漏れは増えませんでした。
また、最初のリンパ節だけの働きを弱めると、その次のリンパ節がより多くつかまえて補い、血液への漏れは増えませんでした。つまり、下流のリンパ節が「代わりに働く」仕組みがありました。
炎症でリンパ節が腫れて形が変わると、SMBの帯状パターンははっきりしなくなりましたが、排液領域(ある体の部位から出たリンパ液が集まり、同じ流れ道で複数のリンパ節へ運ばれる範囲のことです。)全体での取り込みはむしろ増え、血液への漏れは減りました。炎症による作り変えが、ろ過能力を高める場合があることが示されました。

8〜12週齢のマウスを使い、通常のマウスに加えて、B細胞がいないマウスや、末梢のリンパ節(リンパ液が流れ込む途中にある小さな器官で、異物をつかまえて取り除き、免疫反応を起こすきっかけを作ります。)がほとんどないマウスも用いました。
蛍光トレーサー(体内の流れや取り込みを調べるために使う、光る目印をつけた物質です。)（デキストラン(糖がつながった高分子で、サイズを調整しやすく、リンパ節での捕捉の実験によく使われます。)、LPS(細菌の細胞壁成分で、免疫を強く刺激する物質として実験に使われます。)、タンパク質、ビーズなど）を皮下に注射し、1時間後にリンパ節を取り出して観察しました。リンパ節全体の蛍光の見え方を調べる方法と、薄い切片にして顕微鏡で細胞の位置関係を調べる方法の両方を行いました。
細胞ごとの取り込み量はフローサイトメトリー(細胞を1個ずつ流しながら、表面の目印や蛍光の強さを測って、どの細胞がどれだけ物質を取り込んだかを調べる方法です。)で測定し、どの細胞集団がどれだけ取り込んだかを数値化しました。マクロファージ(体内のゴミや病原体を食べて分解する免疫細胞で、異物の除去に重要です。)を減らす実験では、clodronate liposomes(マクロファージに取り込まれるとマクロファージを減らせる薬剤入りの小さな粒で、マクロファージの役割を調べるのに使います。)を注射してマクロファージを枯渇(特定の細胞を実験的に大きく減らして、機能への影響を見る方法です。)させました。炎症による変化は、CFA(免疫反応や炎症を強く起こすために使われる試薬で、リンパ節の腫大モデルを作るのに用います。)と抗原を使ってリンパ節を腫大させてから調べました。血液への漏れは、血清中の蛍光物質をELISA(液体中にある特定の物質の量を、抗体を使って測定する方法です。)で測って評価しました。

リンパ節(リンパ液が流れ込む途中にある小さな器官で、異物をつかまえて取り除き、免疫反応を起こすきっかけを作ります。)のろ過は、リンパ節の髄質(リンパ節の内側寄りの部分で、リンパ液が流れる洞やマクロファージが多く、異物を処理しやすい場所です。)全体でぼんやり起きるのではなく、SMB(被膜下洞と髄質洞の境目付近にある特別な領域で、網目構造とマクロファージが集まり、ろ過の中心になります。)という限られた場所に集中して起きることが示されました。SMBでは、網目状のリンパ管(リンパ液を運ぶ管で、体中に広がり、途中でリンパ節につながります。)内皮細胞と髄質洞(リンパ節の中でリンパ液が流れる空間で、リンパ管内皮細胞によって形づくられます。)マクロファージ(体内のゴミや病原体を食べて分解する免疫細胞で、異物の除去に重要です。)が密な構造を作り、物理的なバリアとしてリンパ液(血液からしみ出した水分などが集まった体液で、体のすき間の液体や異物成分を運び、最終的に血液へ戻ります。)中の物質をつかまえます。
この仕組みの中心となる細胞は髄質洞マクロファージであり、今回の指標（Dex-FITC）で見るかぎり、表面側の洞のマクロファージ(被膜下洞にいるマクロファージで、抗原をB細胞反応につなげる役割が知られますが、本研究の指標では主役ではありませんでした。)は必須ではないことが示されました。また、SMBを見つける目印としてMARCO(マクロファージなどが持つ受容体の一種で、SMBの領域を見分ける目印として役立ちます。)が役立つことも示されました。
さらに、同じ排液領域(ある体の部位から出たリンパ液が集まり、同じ流れ道で複数のリンパ節へ運ばれる範囲のことです。)にある複数のリンパ節が段階的に協力して、リンパ由来の物質が血液に入るのを防いでいることが数量的に示されました。どこかのリンパ節の働きが落ちても、下流のリンパ節が補えるため、全体として「門番」の役割を果たせる仕組みになっていると考えられます。炎症でリンパ節や流れ道が変わると、ろ過能力が下がるどころか上がる場合がある点も重要です。