抹茶は肺炎球菌に対して殺菌作用および肺炎球菌由来の細胞膜傷害毒素ニューモリシンに対して阻害作用を示す

Streptococcus pneumoniae（肺炎球菌）は、侵襲性感染症および呼吸器感染症（例：髄膜炎、敗血症、肺炎）の主要な原因であり、特に乳幼児、高齢者、免疫不全者でリスクが高い。抗菌薬が依然として標準治療である一方、抗菌薬耐性の増加—著者らの先行観察では臨床分離株の80%以上がmacrolidesに非感受性—により、既存の抗菌薬に依存しない新たなアプローチが求められている。有望な戦略の一つは、肺炎球菌の病原性因子を標的とすることであり、とりわけ pneumolysin（PLY）に注目が集まる。PLYは孔形成性のcholesterol-dependent cytolysinで、実質的にすべての肺炎球菌分離株に存在し、定着、侵入、炎症、宿主細胞傷害に重要である。PLYの毒性にはoligomerizationと孔形成が必要であるため、この過程を阻害できれば病態の軽減につながり得る。緑茶は抗菌作用や呼吸器の健康上の利益と関連づけられており、抹茶は粉末化した「Tencha」を懸濁して摂取され、EGCGなどのcatechinsを含む生理活性化合物が比較的高濃度で含まれる。しかし、抹茶の肺炎球菌（S. pneumoniae）への影響や、PLY活性への影響は、これまでほとんど不明だった。そこで本研究は、(i) 抹茶緑茶が、抗菌薬感受性株および多剤耐性株の両方の肺炎球菌に対して抗菌活性を示すか、(ii) 抹茶およびそのcatechinsが、in vitroでPLY介在性の機能的な細胞毒性を阻害するか、を検証することを目的とした。

抹茶上清（matcha supernatant）は、抗菌薬感受性株（D39）および多剤耐性株（KM256）の両方のS. pneumoniaeの増殖を、用量依存的に抑制した。20 mg/mL（一般的に調製される飲料を反映する濃度として選定）では、抹茶上清は増殖をほぼ完全に抑え、生菌数を90%以上減少させた。これは、抗菌薬感受性に依存しない直接的な殺菌活性を示す所見である。抗菌作用に加えて、抹茶上清はPLYの機能も低下させた。抹茶を事前に加えてインキュベートすると、recombinant PLY（rPLY）の溶血活性が用量依存的に抑制され、40 μg/mLという低濃度でも阻害が認められた。D39培養上清中の溶血活性も、増殖中に抹茶が存在すると低下し（2.5 mg/mL：生菌数には影響しないと報告される濃度）、未処理培養の上清に抹茶を直接添加した場合にも溶血は抑制された。ヒト細胞関連アッセイでは、抹茶上清は試験した濃度範囲において2 hではA549肺胞上皮細胞に対する明確な細胞毒性を示さなかったが、16 hでは濃度≥10 mg/mLで生存率が低下し、5 mg/mLでは低下しなかった。機能面では、抹茶上清（1および5 mg/mL）が、rPLY誘導性のヒト好中球死を有意に防御した。機序として、抹茶に多く含まれるcatechins（EGCG、EGC、ECG）はrPLYの溶血を有意に抑制し、rPLYのoligomerizationも低下させた一方、ECは溶血阻害を示さず、oligomerizationへの明確な影響も認められなかった。好中球アッセイでは、EGCG、EGC、ECGがrPLY曝露下で生存率を大きく改善し、ECは中等度の改善にとどまった。試験したすべてのcatechinsは、rPLYで刺激した好中球の上清中のneutrophil elastase（NE）活性を有意に低下させた。

使用した肺炎球菌株は2株で、抗菌薬感受性のS. pneumoniae D39と、多剤耐性株KM256（報告されているMIC：penicillin Gで>8 μg/mL、ceftriaxoneで8 μg/mL、azithromycinで4 μg/mL、levofloxacinで>8 μg/mL）である。菌は37°Cでtryptic soy broth（TSB）中で培養した。抹茶上清は、抹茶粉末をTSBまたはPBSに懸濁し、65°Cで120 min加熱後、遠心（5000×g、10 min）して固形分を除去して調製した。この抽出条件は、予備実験で最も強い殺菌効果が示されたため選択された。増殖抑制試験では、対数増殖期培養に1.25–20 mg/mLの抹茶上清を曝露し、時間経過でOD600を測定した。殺菌効果は（結果に記載の方法で）生菌数で評価した。毒素阻害の評価では、溶血アッセイとして、ヒツジ赤血球（1% v/v）にrPLY（1 μg/mL）と、さまざまな濃度の抹茶（20–300 μg/mL）またはcatechins（0.1または1 mg/mL）を混合し、37°Cでインキュベートした後、マイクロプレートの吸光度で溶血を定量した。溶血ユニットは、標準条件下で50%溶血を引き起こすrPLY量として定義した。機序解析として、rPLYを抹茶またはcatechinsとインキュベートし、赤血球に曝露した後に、anti-PLY monoclonal antibody clone PLY-4を用いたWestern blottingでoligomerization関連の変化を調べた。補助的なタンパク質可視化としてCoomassie染色も用いた。ヒト好中球は、健常ドナーからPolymorphprepTMを用いて分離し、インフォームドコンセントと機関承認（permit # 2018-0075）を得た。rPLY刺激（1 μg/mL）を抹茶／catechinsの有無で行った後の好中球生存率は、Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kitと共焦点顕微鏡で評価した。培養上清中のNE活性は、基質N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val p-nitroanilideを用い、6 h後に405 nmの吸光度で測定した。抹茶上清（5、10、20 mg/mL）のA549に対する細胞毒性は、2 hおよび16 hでMTT assayにより評価した。統計解析にはANOVA（Dunnett’sまたはTukey’sのpost hoc検定）またはStudent’s t-testを用い（GraphPad Prism 8.4.3）、検定した。

本研究は、20 mg/mLの抹茶緑茶上清が、in vitroでS. pneumoniae（多剤耐性株を含む）に対して殺菌活性を示し、さらに抹茶が機能的なpneumolysinを阻害することで抗毒素（antitoxin）としても作用すると結論づけた。著者らは、PLYによる孔形成がoligomerizationに依存し、免疫細胞傷害に寄与することから、毒素に関する所見は生物学的に意味があると論じている。実際に、抹茶上清および特定のcatechins（EGCG、EGC、ECG）は、rPLYの溶血を低下させ、rPLYのoligomerizationを阻害し、好中球をrPLY誘導性の細胞死から保護し、好中球上清中のNE活性を低下させた。さらに本研究は重要な技術的含意として、抹茶上清がWestern blotでのanti-PLY抗体検出を妨害した（Coomassie染色でのタンパク質プロファイルが同様であるにもかかわらず、モノマーのバンドがより狭く／薄くなる）ことを示し、PLY-4のepitopeとの競合拮抗の可能性を示唆するとともに、抹茶成分が存在する場合には免疫検出に基づく解釈に注意が必要であると強調した。著者らは、これらの抗菌作用と抗病原性（antivirulence）作用の組み合わせが、薬剤耐性が増加する肺炎球菌感染症に対し、予防または治療成績改善を目指す戦略として抹茶由来成分が有望であることを支持すると位置づけている。同時に、抹茶の殺菌作用の機序は解明されておらず、また本研究の調製法は茶粉を除去し、通常の摂取と異なる抽出条件（65°Cで120 min）を用いているため、in vitroの結果が実際の摂取状況を直接反映しない可能性があるという、翻訳（臨床応用）上の限界も強調している。

肺炎球菌は、肺炎や髄膜炎、敗血症などの重い感染症の原因になる細菌で、特に乳幼児や高齢者、免疫の弱い人ほどかかりやすいです。治療には抗菌薬がよく使われますが、効きにくい（耐性をもつ）肺炎球菌が増えていて、新しい対策が必要になっています。
そこで注目されているのが、肺炎球菌が病気を起こすときに使う「毒素」などの働きを弱める方法です。特に、pneumolysin(肺炎球菌が作る毒素で、細胞の膜に穴を開けて壊します。感染を悪化させる大きな要因なので、新しい治療標的として重要です。)（PLY）という毒素は、ほとんどすべての肺炎球菌が持っていて、体の細胞を傷つけたり炎症を強めたりする重要な因子です。PLYは集まって穴を作ることで細胞を壊すため、この過程を止められれば症状を軽くできる可能性があります。
緑茶には体に良い成分があるとされ、抹茶は茶葉を粉末ごと飲むため、カテキン（例：EGCG(カテキンの一種で、緑茶成分の中でも働きが強いとされます。この研究ではPLYの働きを抑える中心的な候補として扱われました。)）などの成分が比較的多いのが特徴です。しかし、抹茶が肺炎球菌そのものやPLYにどう影響するかは、ほとんど分かっていませんでした。
この研究では、抹茶が①薬が効く肺炎球菌にも薬が効きにくい肺炎球菌にも抗菌作用を示すか、②抹茶やカテキンがPLYによる細胞へのダメージを試験管内で抑えるか、を調べました。

抹茶の上澄み液は、薬が効く肺炎球菌（D39）と多剤耐性の肺炎球菌（KM256）の両方で、濃度が高いほど増殖を強く抑えました。飲用の抹茶を想定した濃度である20 mg/mLでは、増殖をほぼ止め、生きている菌の数を90%以上減らしました。つまり、薬剤耐性かどうかに関係なく、抹茶には直接的に菌を減らす力がある可能性が示されました。
さらに抹茶は、PLYの働きも弱めました。抹茶と混ぜておくと、組換えPLYの赤血球を壊す力（溶血活性(赤血球が壊れる程度を表す指標です。PLYの毒性の強さを測る代表的な方法として使われます。)）が濃度に応じて下がり、低い濃度でも抑制が見られました。肺炎球菌の培養液に抹茶がある場合も、培養後の上澄みに抹茶を加える場合も、溶血は抑えられました。
人の細胞を使った試験では、A549(人の肺胞上皮細胞の培養細胞で、肺の細胞への影響を調べるモデルとして使われます。安全性や毒性評価で重要です。)肺胞上皮細胞に対して、短時間（2時間）では抹茶のはっきりした毒性は見られませんでしたが、長時間（16時間）では高濃度で細胞の生存率が下がりました。一方、抹茶は好中球(体を細菌から守る白血球の一種です。肺炎などの感染防御で重要ですが、強く傷つくと周囲の組織もダメージを受けます。)に対して、PLYが引き起こす細胞死を有意に防ぎました。
成分ごとの検討では、抹茶に多いカテキンのうちEGCG(カテキンの一種で、緑茶成分の中でも働きが強いとされます。この研究ではPLYの働きを抑える中心的な候補として扱われました。)、EGC(カテキンの一種で、PLYの毒性を下げる作用が示されました。抹茶の効果に関わる成分候補です。)、ECG(カテキンの一種で、EGCGやEGCと同様にPLYの働きを抑えました。成分ごとの違いを考えるうえで重要です。)はPLYの溶血を強く抑え、PLYが集まる過程も弱めましたが、EC(カテキンの一種ですが、この研究ではPLYの溶血を抑える効果がほとんど見られませんでした。カテキンの種類で作用が変わることを示します。)は溶血を抑えませんでした。さらに、どのカテキンも、PLY刺激で増える好中球エラスターゼの活性を下げました。

肺炎球菌は2種類を使いました。薬が効くD39株と、多剤耐性のKM256株です。菌は培地で培養しました。
抹茶の上澄み液は、抹茶粉末を培地または緩衝液に混ぜ、65℃で120分加熱したあと、遠心分離して粉を取り除いて作りました（この条件が予備実験で最も強い殺菌効果を示したため）。
増殖の評価は濁り（OD600）で追跡し、殺菌効果は生菌数で確認しました。PLYの働きは、ヒツジ赤血球を使う溶血試験で測りました。PLYが集まる過程は、Western blotで調べました。
また、健康な人の血液から好中球(体を細菌から守る白血球の一種です。肺炎などの感染防御で重要ですが、強く傷つくと周囲の組織もダメージを受けます。)を分離し、PLYを加えたときの好中球の生存率や、培養上清中の好中球エラスターゼ活性を測定しました。A549(人の肺胞上皮細胞の培養細胞で、肺の細胞への影響を調べるモデルとして使われます。安全性や毒性評価で重要です。)細胞への影響はMTT法で評価しました。

この研究は、抹茶の上澄み液が試験管内で肺炎球菌（多剤耐性株を含む）を減らし、同時にPLYという毒素の働きも抑える可能性を示しました。特に、EGCG(カテキンの一種で、緑茶成分の中でも働きが強いとされます。この研究ではPLYの働きを抑える中心的な候補として扱われました。)、EGC(カテキンの一種で、PLYの毒性を下げる作用が示されました。抹茶の効果に関わる成分候補です。)、ECG(カテキンの一種で、EGCGやEGCと同様にPLYの働きを抑えました。成分ごとの違いを考えるうえで重要です。)などのカテキンは、PLYが集まって穴を作る過程を邪魔し、赤血球の破壊や好中球(体を細菌から守る白血球の一種です。肺炎などの感染防御で重要ですが、強く傷つくと周囲の組織もダメージを受けます。)の死を減らし、好中球エラスターゼ活性も下げました。
一方で、抹茶があるとPLYを抗体で検出する実験（Western blot）がうまくいかなくなる可能性も示され、抹茶成分が抗体の結合を邪魔するかもしれない点は、実験結果の解釈で注意が必要です。
また、この研究は試験管内の結果であり、抹茶の作り方も実際の飲み方と同じではないため、現実の摂取で同じ効果が得られるとはまだ言えない、という限界も示されました。