Trophic modulation of endophytes by rhizosphere protists

本論文は、根圏（rhizosphere）における微生物の捕食者―被食者相互作用が、根の内部に存在する植物関連細菌群集にどのような影響を及ぼすかを検討している。貪食性（phagotrophic）のprotist（原生生物）は豊富な微生物捕食者であり、細菌を選択的に捕食することで、被食者の除去と栄養塩の循環（nutrient turnover）を通じて細菌群集の組成を作り替える。根圏細菌が根内生（endophytic）細菌の主要な供給源であり、またprotistが根圏細菌群集（rhizobacterial communities）を改変し得ることは既に確立している一方で、著者らは、protistによる捕食が根内生（root endophyte）群集にもたらす帰結はこれまで研究されていないと指摘する。そこで著者らは、(i) protistが根圏細菌を捕食することにより、根内生（RE）細菌群集の組成が調節される、(ii) protistの存在により内生的な定着（endophytic colonization）が増加する、という仮説を立てた。これは、根の内部が根への定着能力（root-colonization competence）をもつ細菌の避難場所（refuge）として機能し得るためであり（protistは内生であることが知られていない）、という考えに基づく。さらに、protistの摂食は種特異的であることから、結果はprotistの種類（identity）に依存すると予想した。環境条件にまたがる頑健性を検証するため、著者らは分類学的に異なる3種のprotist—Acanthamoeba castellanii（Ac）、Vermamoeba vermiformis（Vv）、Heteromita globosa（Hg）—を用い、日本の水田土壌3種においてイネ（Oryza sativa L. Nipponbare）のmicrocosmで実験した。また、結果が決定論的（deterministic）か、あるいは栄養レベルなど初期条件に敏感な「決定論的カオス（deterministic chaos）」を示し得るかも検討した。

すべての土壌において、3種のprotistはいずれも、根圏土壌（RS）と根内（root endosphere; RE）の両方で細菌群集組成を有意に変化させた一方、alpha diversityは有意に変化させなかった。オーディネーション（PCoA, Bray–Curtis）では、両生息場所においてprotist処理がprotistなし対照から別々にクラスタリングし、protistの影響はRSとREの間で類似かつ一貫していると記述された（protist × 生息場所の相互作用は比較的弱い）。差次的存在量（differential abundance）解析では、protist処理下でREにおいて増加または減少したASVは、対応するRSでも同様の増加または減少を示す傾向があり、内生群集の変化がprotistによる根圏再編に由来するという主張を支持した。random forestによる解析もこの結びつきを補強した。RSデータで学習したモデルは、protistが存在する場合にREの処理ラベルをより良く予測でき、報告された正答率は対照で75.8%、protist存在下ではより高く（Ac 91.9%、Hg 83.4%、Vv 79.2%）なった。しかし、protistの効果は異なる土壌間で再現的ではなかった。protistの影響を受けたASVの>90%は土壌特異的であり、科（family）レベルでも影響を受けた科のうち土壌間で重なったのは4.2%にとどまった。多くのASVが全土壌に存在していたにもかかわらず、土壌によって増加／減少の傾向が逆になるASVもあった。焼成粘土（calcined clay）と定義済み栄養溶液を用いた追試では、栄養の希釈（x1.00, x0.75, x0.50）を変えると、各protistが各希釈レベルで異なるREのASVに影響し、全希釈に共通して増加／減少するASVは実質的に存在しなかった（例外としてAcで増加したASVは<10%が重複）。著者らはこれを、栄養という初期条件によって引き起こされるカオス的ダイナミクスと解釈した。protistの種類の違いも強く影響した。両実験で、影響を受けたASVの>60%は特定のprotistに固有で、3種すべてに共有されるものは<15%だった。種特異性は減少したASVより増加したASVで強く（増加したtaxaのうち>75%が固有）、この傾向が示された。最後に、qPCRにより、両実験でprotist処理は対照と比べてRE（ただしRSではない）における総細菌遺伝子量（total bacterial gene abundance）を有意に増加させることが示され、protist捕食者の存在下で内生的定着が促進されるという結果と整合した。

本研究では、背景の土壌生物相からprotistの効果を分離し、環境間で結果を比較するために、制御されたイネのmicrocosmを用いた。水田土壌は日本の3地点から採取され、異なる土壌型と性質を代表するものとして、Soil 1（Stagnosol; Chita, Aichi）、Soil 2（Fluvisol; Niigata）、Soil 3（Andosol; Matsumoto, Nagano）を、深さ0–10 cmから採取した。土壌はγ線照射（25 kGy, 60Co）により滅菌した。各土壌について、土壌懸濁液を1.2 μmメンブレンでろ過して「protist-free」の在来細菌接種液を作成し、対応する細菌群集（~10^7 cells g^-1 dry soil）で滅菌土壌を再接種した。無菌（axenic）のprotist培養を、3処理（Ac, Vv, Hg）では土壌1 g当たり~500 cellsで添加し、protistなし対照（CK）も設けた。各土壌は4処理×10反復とした。microcosm（50 mlチューブに土壌40 g）は、1週間水没条件で予備培養した後、滅菌した14日齢のイネ苗を1本植え、チャンバー内で水没条件のまま25/30°C（昼/夜）、日長16 h、250 μmol m^-2 s^-1で育成した。破壊サンプリングは3週および6週に実施し（各時点5反復）、RS（0.5 g）と表面滅菌した根（0.15 g）からDNAを抽出した。続いて16S rRNA V4アンプリコンシーケンス（515F/806R; Illumina MiSeq）を行い、抽出およびPCRの陰性対照も含めた。総細菌遺伝子量はqPCRで定量した。群集差はBray–Curtisに基づくオーディネーション、PERMANOVA、ASVレベルでの差次的存在量検定（DESeq）により評価し、相対存在量と絶対存在量の両方のアプローチを用いた。RSのパターンがREの結果を予測できるかを検証するため、random forestモデルも用いた。第2の実験では、初期栄養条件への感受性を検証するため、不活性基質として滅菌した焼成粘土（calcined clay）を用い、Kimura B栄養溶液（pH: 5.8）をx1.00、x0.75、x0.50に希釈して、Soil 1の細菌群集と同じ4つのprotist処理（各5反復）を適用し、3週時点で1回サンプリングした。配列データはBioProject ID PRJNA1106748として登録された。

著者らは、根圏の捕食性protistが根内生細菌群集を調節し得ること、そして内生群集の変化は主として周囲の根圏群集におけるprotist駆動の変化を反映することを結論づけた。さらに、protistには選択的摂食行動があるにもかかわらず、影響を受ける具体的なtaxaは土壌や栄養条件が異なると信頼性高く予測できないと主張し、その理由として、結果が初期条件に強く依存し、決定論的カオスと整合する形で変動するためだと論じた。焼成粘土を用いた栄養操作実験は、栄養によって引き起こされるカオス的ダイナミクスの直接的根拠として提示され、栄養希釈の小さな違いが、重複の少ない別個の「protistの影響を受けたASV集合」を生み出した。組成変化に加えて、protistは根内の総細菌遺伝子量を増加させ、捕食者の存在が内生的定着を高めるという仮説を支持した。機構は解明されていないものの、著者らは、根が捕食からの避難場所になり得ること、また内生適性（endophytic competence）に関わる形質（例：運動性（motility）やEPS産生）がprotist捕食への抵抗にも寄与し、根内への「逃避（escape）」を促し得ることを提案する。さらに、protistが本系でイネのバイオマスを増加させたことにも触れ、これが根密度や根からの分泌（exudation）の増加を通じて内生的定着を間接的に促進し得ると述べている。総じて本研究は、protistを根のmicrobiomeに影響する重要だがこれまで過小評価されてきた調節因子として位置づけ、作物の生産性に関わる地下部の複雑な生態学的相互作用を理解・予測・管理するうえで、カオス的ダイナミクスを認識する重要性を示唆している。

本論文は、protistによって根内生細菌量が増える機構、および観察された種特異的な増加パターンの背景を明らかにするため、さらなる研究が必要であると明示的に述べている。特に、増加したtaxaが減少したtaxaよりも強いprotist種特異性を示す理由は未解決であり、検証可能な考えとして、排泄される栄養塩の組成や量がprotist種ごとの栄養要求に依存するため、栄養塩の循環（nutrient turnover）がprotist間で異なる可能性を提案している。また、土壌比較と栄養希釈の結果が示唆する「決定論的カオス（deterministic chaos）」は一般化を難しくし、どの細菌taxaが増加／減少するかを予測するには、栄養状態や初期群集組成といった初期条件を明示的に考慮する必要があると強調している。より広い観点では、捕食者―被食者ダイナミクスの予測的理解を高め、環境変化下での持続可能な管理手法を開発するために、生態学的思考にカオスを取り入れる必要があると論じる。さらに、protistが駆動し得る、場合によってはカオス的な根圏群集の変調をより深く認識することは、作物生産の改善を目的とした根のmicrobiomeの意図的な調節に向けた新たな道を開き得ると示唆するが、これは実証された応用ではなく含意として位置づけている。

この研究は、植物の根のまわりの土（根圏(生きている植物の根のすぐ周りの土の領域です。根からいろいろな物質が出るため栄養が集まりやすく、細菌などの微生物が多くなりやすい重要な場所です。)）にいる微生物を食べる生き物が、根の中に住みつく細菌の集まりにどんな影響を与えるのかを調べたものです。
protist(動物や植物、菌類とは別のグループに入る小さな生物の総称で、単細胞のものが多いです。細菌を食べる種類もいて、土の中で細菌の増え方や種類のバランスに影響します。)という小さな生き物の中には、細菌をえさとして食べる種類がいます。protistが細菌を選んで食べると、食べられやすい細菌は減り、食べられにくい細菌が増えやすくなります。また、食べられた細菌から出た栄養がまわりに広がることで、細菌の集まり方も変わります。

根の中にいる細菌（根内生細菌(植物の根の内部に入り込み、そこで生活する細菌です。植物の成長や病気への強さに関わることがあり、植物の健康を考えるうえで重要です。)）は、主に根圏の細菌が入り込むことで増えると考えられています。そこで研究者は、protistが根圏の細菌を食べることで、根の中の細菌の種類のバランスも変わるはずだと予想しました。さらに、protistがいると、細菌が根の中に逃げ込むように入りやすくなり、根の中の細菌量が増えるのではないか、という予想も立てました。

また、protistは種類によって食べ方や好むえさが違うので、影響はprotistの種類によって変わると考えました。そこで、日本の水田の土を3種類使い、イネを育てる小さな実験環境で、3種類のprotistを入れた場合と入れない場合を比べました。加えて、土の違いだけでなく栄養の条件を少し変えただけでも結果が大きく変わるかどうかも確かめました。

まず、どの土でも、3種類のprotist(動物や植物、菌類とは別のグループに入る小さな生物の総称で、単細胞のものが多いです。細菌を食べる種類もいて、土の中で細菌の増え方や種類のバランスに影響します。)は根圏(生きている植物の根のすぐ周りの土の領域です。根からいろいろな物質が出るため栄養が集まりやすく、細菌などの微生物が多くなりやすい重要な場所です。)と根の中の両方で、細菌の集まり方（どの細菌が多いか）をはっきり変えました。一方で、細菌の種類数の多さのような指標は大きく変わりませんでした。

次に、根の中で増えたり減ったりした細菌の特徴が、根圏でも同じように増減していることが多く見られました。つまり、根の中の変化は、まず根圏の細菌集団がprotistの影響で組み替わり、その結果が根の中にも反映された可能性が高いと考えられます。

ただし、protistが「どの細菌に影響するか」は、土が違うとあまり再現されませんでした。影響を受けた細菌の多くは、その土に特有で、別の土では同じ細菌が増えたり減ったりしないことが多かったです。

さらに、土の代わりに焼成粘土(高温で焼いて作った、微生物にとって栄養になりにくい素材です。土の代わりに使うことで、栄養条件だけをはっきり変える実験がしやすくなります。)を使って栄養の濃さだけを少し変える実験をすると、栄養の濃さが少し違うだけで、protistが影響する細菌の顔ぶれが大きく変わりました。共通して増えたり減ったりする細菌はほとんどありませんでした。研究者はこれを、初期条件（ここでは栄養の違い）にとても敏感で、結果が予測しにくくなる現象として説明しました。

また、protistの種類の違いも大きく、影響を受けた細菌の多くは特定のprotistにしか見られないものでした。特に「増えた細菌」のほうが、protistの種類ごとの違いが強く出ました。

最後に、根の中の細菌の総量は、protistを入れたほうが増えました（根圏では大きな増加は見られませんでした）。これは、protistがいることで細菌が根の中に定着(細菌などが特定の場所に入り込み、そこで増えたり長く生きたりして、安定して住みつくことです。根の中への定着が増えると、根の中の細菌量が増えます。)しやすくなる、という予想と合っています。

研究者は、イネを育てる小さな容器内の実験環境を作り、土の中の微生物の条件をできるだけそろえて比較しました。日本の水田から性質の異なる土を3種類集め、まず放射線で土を滅菌しました。その後、その土にもともといた細菌だけを取り出して土に戻し、そこへ3種類のprotist(動物や植物、菌類とは別のグループに入る小さな生物の総称で、単細胞のものが多いです。細菌を食べる種類もいて、土の中で細菌の増え方や種類のバランスに影響します。)のどれかを加える条件と、protistを加えない条件を用意しました。

イネの無菌苗を植えて育て、途中で根圏(生きている植物の根のすぐ周りの土の領域です。根からいろいろな物質が出るため栄養が集まりやすく、細菌などの微生物が多くなりやすい重要な場所です。)の土と根を回収し、それぞれからDNAを取り出して、細菌の種類の違いを調べました。また、根圏と根の中で細菌がどれくらいいるかも別の方法で測定しました。

追加実験として、土の違いをなくし、栄養の濃さだけを段階的に変えられるように、焼成粘土(高温で焼いて作った、微生物にとって栄養になりにくい素材です。土の代わりに使うことで、栄養条件だけをはっきり変える実験がしやすくなります。)と決まった栄養溶液を使った実験も行いました。

この研究から、根圏(生きている植物の根のすぐ周りの土の領域です。根からいろいろな物質が出るため栄養が集まりやすく、細菌などの微生物が多くなりやすい重要な場所です。)にいる細菌を食べるprotist(動物や植物、菌類とは別のグループに入る小さな生物の総称で、単細胞のものが多いです。細菌を食べる種類もいて、土の中で細菌の増え方や種類のバランスに影響します。)が、根の中の細菌集団も変えられることが示されました。そして根の中の変化は、主に根圏の細菌集団がprotistによって変わることの影響を受けていると考えられます。

一方で、protistがどの細菌を増やしたり減らしたりするかは、土や栄養条件が違うと大きく変わり、簡単には予測できませんでした。研究者は、初期条件の小さな違いで結果が大きく変わるタイプの動きが関係している可能性を重視しています。

また、protistがいると根の中の細菌量が増えたことから、細菌が捕食を避けるために根の中へ入りやすくなる可能性も示されました。根の中は、protistが入り込まないと考えられているため、細菌にとって避難場所になりうる、という考え方です。

この研究は、protistを「根のまわりの微生物の世界を動かす重要な存在」として位置づけ、作物の生育に関わる地下の生態系を理解するうえで、結果が予測しにくくなる仕組みも含めて考える必要があることを示しています。

今後は、なぜprotist(動物や植物、菌類とは別のグループに入る小さな生物の総称で、単細胞のものが多いです。細菌を食べる種類もいて、土の中で細菌の増え方や種類のバランスに影響します。)がいると根の中の細菌量が増えるのか、そのしくみをはっきりさせる研究が必要です。特に、減った細菌よりも増えた細菌のほうがprotistの種類ごとの違いが強く出た理由はまだ分かっていません。研究者は、protistが排出する栄養の内容が種類によって違い、それが増える細菌を変えている可能性を挙げています。

また、どの細菌が増減するかを予測するには、土の栄養状態や最初にいた細菌の組み合わせなどの初期条件を、より具体的に考える必要があるとしています。より広い意味では、捕食者と被食者の関係を理解して管理するために、予測しにくい動きも含めた考え方が重要だと述べています。