Homozygous slc25a20 zebrafish mutant reveals insights into carnitine-acylcarnitine translocase deficiency pathogenesis

Carnitine-acylcarnitine translocase（CACT）欠損症はまれな常染色体劣性疾患で、カルニチンサイクルに必須の、301アミノ酸からなるミトコンドリア内膜のアンチポーターをコードするSLC25A20の病的バリアントによって生じる。CACTはミトコンドリア内膜を介してL-carnitineおよび長鎖acylcarnitinesを輸送し、acyl CoAへの変換と、それに続くミトコンドリアβ-oxidationによるエネルギー産生を可能にする。CACT機能が障害されると、長鎖脂肪酸からのエネルギー産生が低下し、長鎖acylcarnitinesが蓄積して臓器機能障害に寄与する。とりわけ心臓、骨格筋、肝臓で顕著である。臨床的には、CACT欠損症は多くの場合、重篤な新生児発症型として現れ、急速に悪化して死亡率が高いが、より軽い遅発型の表現型も存在し、重症例でも適切な診断と食事中心の治療によりより長く生存できる場合がある。病態の理解と治療改善の進展は、報告症例数の少なさと適切な病態モデルの欠如によって制約されてきた。そこで本研究は、in vivoでの遺伝子機能を明らかにし、ヒトCACT欠損症の主要な病理学的特徴を再現するモデルを確立するため、ゼブラフィッシュのslc25a20変異体を作製して特性づけることを目的とした。

CRISPR/Cas9編集により、exon 2に2-bp挿入をもつslc25a20アレル（NM_200859.1: c.152_153insCA p.(Ala52Thrfs*31)）が作製された。この変異はタンパク質の大部分（83.0%の喪失）を欠失させ、輸送機能に関与するとされる残基を除去すると予測されることから、強いloss-of-functionであるとの解釈を支持した。発現解析では、slc25a20は成体の各組織で広く発現し、脳、心臓、腸、肝臓、皮膚で転写産物量が高いことが示された。また、in situ hybridizationにより幼若個体でも広範な発現が示された。ホモ接合変異体は顕著な致死性を示し、約1.5～3.5か月齢のF2個体で遺伝子型判定された48匹のうち、ホモ接合体は1匹（2%）のみであり、成熟までの生存に対して強い選択圧が働いていることが示唆された。このまれな成体生存個体の組織病理では、著者らがヒトCACT欠損症に類似すると解釈する表現型が認められた。すなわち、体腔内および皮下領域における成熟脂肪組織の目立つ蓄積、心臓肥大（心室心筋細胞の高密度化と血液を含むスペースの減少を伴う）、脂質様滴に一致するeosin陰性の空胞や多数の細胞内粒子といった心筋細胞異常、さらに（特に体表近くおよびmyoseptum周囲で顕著な）脂質貯蔵ミオパチーと変性に一致する骨格筋変化である。肝臓の病理は一部のヒト報告とは程度が異なり、変異体肝では大きな油滴空胞は認められず、azan染色でも有意な線維化は示されなかったが、肝細胞には小さなeosin陰性空胞（小さな脂質滴の可能性があると解釈）と細胞形態の変化がみられた。Prussian blue染色では、変異体肝に限局性の微量な鉄沈着が、脾臓には相当量の沈着が検出された一方、野生型では顕著な鉄沈着は認められなかった。検討されたこの成体1個体においては、腎臓と脳は野生型と比べて有意な差は観察されなかった。

著者らは、slc25a20を標的とするguide RNA（GGAGAAGTCGCGCAGTACGCCGG; 25 ng/μl）とCas9 protein（0.6 μg/μl）を1細胞期にCRISPR/Cas9マイクロインジェクションし、slc25a20変異ゼブラフィッシュ（AB系統）を作製した。その後、交配によりF1のヘテロ接合系統を得た。遺伝子型判定は、尾鰭クリッピング、ゲノムDNA抽出、標的座位周辺のPCR増幅（プライマー：TCTGTGTGTGCGTGACCTTTおよびGGCCAGTGTTTTCTTGAAGC）、Sanger sequencingによりexon 2挿入を同定し、子孫を分類した。発現パターンの評価では、9臓器（各3生物学的リプリケート）に関する公開の成体ゼブラフィッシュRNA-seqデータ（GSE171906）を利用し、発現はtranscripts per million（TPM）の平均と標準誤差として要約した。幼若個体での空間的発現は、DIG標識リボプローブを用いたmRNA in situ hybridizationで検討し、シグナル特異性を支持するため、無関係な2種類のプローブも並行して実施し、異なるパターンを観察した。病理評価として、成体ホモ接合変異体1個体と同齢の野生型オスを0.1% Tricaineで安楽死させ、4% paraformaldehydeで固定し、EDTAで脱灰し、パラフィン包埋後、3 μmで切片作製し、hematoxylin-eosin（HE）、azan、Prussian blueでそれぞれ一般形態、線維化/結合組織所見、鉄沈着を評価した。著者らは、例外的にまれな成体生存個体への依存により、定量的な分子アッセイ（例：qPCR、Western blotting）や広範な再現の実施が制限されたことを明確に認めている。

本研究は、CRISPRで作製したゼブラフィッシュslc25a20フレームシフト変異体が、CACT欠損症に対する潜在的に有用なin vivoモデルになりうると結論づけている。主な根拠は、ホモ接合変異体が強い致死性を示し、成体生存個体で、著者らがヒト疾患で報告される所見と概ね相同と判断する組織異常が観察された点である。特に、心臓と骨格筋の表現型（肥大、変性、脂質様空胞化）は、ミトコンドリアβ-oxidation障害によって最も影響を受ける臓器系に関する、CACT欠損症の臨床的・病理学的な特徴とよく一致すると強調され、モデルの関連性を支持するとされた。一方で、結論は大きな限界により制約されることも示されている。すなわち、詳細な組織学的検討が可能だったホモ接合の成体が1個体のみであること、発生過程のどの時点で致死に至るかが未解明であること、また独立系統がない限りCRISPRのoff-target effectを完全には排除できないこと（ただし著者らは、ヒト病理との種を超えた類似性から、off-targetの大きな寄与は起こりにくいと主張している）である。体腔内の顕著な脂肪蓄積や、肝臓での大きな脂質滴の欠如、明らかな線維化の不在といった差異はあるものの、全体として本研究の所見は、ゼブラフィッシュでslc25a20機能が失われるとCACT欠損症病態の主要側面を再現しうること、ひいてはこのまれな疾患に対する扱いやすい病態モデルの不足を補う助けになりうることを示す証拠として提示されている。

著者らは、このゼブラフィッシュモデルにより可能となる複数の方向性を示しつつ、追加検討が必要な不確実性も指摘している。第一に、患者に関連する食事介入（長鎖脂肪の制限、高炭水化物摂取、triheptanoinやmedium-chain triglyceridesなどの補充戦略）の評価と最適化を含む治療開発を本モデルで支援できる可能性を提案し、L-carnitine補充の心毒性をめぐる議論に関するデータ創出にもつながりうるとしている。第二に、孵化前の変異体胚での薬剤スクリーニングが実施可能であり、より長期的には病理を改善する化合物を同定して、胎児期治療の概念に資する可能性を挙げている。第三に、複数の発生時点で遺伝子型判定を行ってホモ接合変異体がいつ死亡するかを明らかにし、死亡直前の組織病理を調べて疾患進行をマッピングすることを推奨している。第四に、現行アレルは重篤で詳細解析を制限するように見えるため、追加の変異系統を作製し、とりわけ軽症の遅発型ヒト表現型に関連する部位特異的変異を導入して、より生存可能で機序研究に適した個体を得ることを提案している。最後に、ヘテロ接合体または致死性の低いホモ接合体を用い、先行報告で示唆されるより広い生物学的役割（slc25a20発現低下と筋老化やがん関連過程との関連など）を検討する可能性を述べているが、これらは本研究で確立された結論ではなく、将来の詳細解析の対象として位置づけられている。

CACT欠損症(CACTが遺伝子の異常でうまく働かず、長鎖脂肪酸からのエネルギー産生が弱くなる病気です。心臓や筋肉、肝臓に強い影響が出やすく、新生児期に重症化することがあります。)はとても珍しい遺伝病で、体が長い鎖の脂肪（長鎖脂肪酸(炭素の数が多い脂肪酸で、体の大きなエネルギー源になりますが、ミトコンドリアで分解するには特別な運搬の仕組みが必要です。)）からエネルギーを作る仕組みがうまく働かなくなる病気です。原因は、SLC25A20(CACTを作るための設計図にあたる遺伝子です。この遺伝子の変異がCACT欠損症の原因になります。)という遺伝子の異常によって、ミトコンドリア(細胞の中にあるエネルギー工場のような部分で、栄養からATPというエネルギーを作ります。心臓や筋肉のようにエネルギーを多く使う臓器で特に重要です。)の内側の膜で物質を運ぶCACTというタンパク質がうまく働かなくなることです。
CACTが働かないと、脂肪からのエネルギー作りが弱まり、さらに長鎖アシルカルニチンが体にたまって臓器に悪影響が出ます。特に心臓、骨格筋、肝臓で問題が起きやすいです。
この病気は多くの場合、生まれてすぐの時期に重症で発症して命に関わりますが、遅れて発症して軽いタイプもあります。また、重症でも早く正しく診断して食事を中心に治療すると、長く生きられることがあります。
しかし患者数が少なく、病気の仕組みを調べたり治療を試したりするための良いモデルが不足していました。そこで研究者は、ゼブラフィッシュ(小型の魚で、遺伝子操作がしやすく子どもが多く生まれるため、ヒトの病気研究のモデル生物としてよく使われます。)でslc25a20遺伝子に変異を入れ、ヒトのCACT欠損症に似た状態を再現できるか調べることを目的にしました。

研究ではCRISPR/Cas9(狙った場所のDNAを切って変化を入れることができる遺伝子編集技術です。生物の病気モデル作りによく使われます。)を使い、slc25a20遺伝子のexon(遺伝子のうち、最終的にタンパク質の設計図として使われる部分です。今回の変異はexon 2に入れられました。) 2に小さな挿入変異を入れたゼブラフィッシュ(小型の魚で、遺伝子操作がしやすく子どもが多く生まれるため、ヒトの病気研究のモデル生物としてよく使われます。)を作りました。この変異により、CACTタンパク質の大部分が作れなくなると予測され、強い機能喪失の変異だと考えられました。
slc25a20は成体の多くの臓器で広く使われていて、特に脳、心臓、腸、肝臓、皮膚で発現が高いことが示されました。若い個体でも広い範囲で発現していました。
ホモ接合(同じ遺伝子について、両方のコピーが同じ変異を持つ状態です。劣性の病気では、この状態で症状が出やすいです。)変異体（両方の遺伝子が変異）の多くは成長途中で死んでしまい、48匹のうち成体まで生き残ったホモ接合体は1匹だけでした。この非常に珍しい生存個体を調べると、ヒトのCACT欠損症(CACTが遺伝子の異常でうまく働かず、長鎖脂肪酸からのエネルギー産生が弱くなる病気です。心臓や筋肉、肝臓に強い影響が出やすく、新生児期に重症化することがあります。)に似ていると考えられる変化が見つかりました。具体的には、体の中や皮下に脂肪組織が目立って増えていること、心臓が大きくなること、心筋細胞(心臓の筋肉を作る細胞で、収縮して血液を送り出す役割があります。エネルギー消費が大きいのでCACT欠損の影響を受けやすいです。)に脂肪滴のように見える空の部分や粒の増加があること、骨格筋でも脂肪がたまり筋肉が傷んでいるような変化があることです。
肝臓は、ヒトの報告で見られるような大きな脂肪滴や強い線維化は目立ちませんでしたが、小さな脂肪滴の可能性がある変化や細胞の形の変化が見られました。また鉄の沈着は、肝臓では少しだけ、脾臓では多く見つかりました。腎臓と脳は、この1匹では大きな差が見られませんでした。

研究者は、受精直後のゼブラフィッシュ(小型の魚で、遺伝子操作がしやすく子どもが多く生まれるため、ヒトの病気研究のモデル生物としてよく使われます。)胚にguide RNAとCas9タンパク質を注入して、slc25a20に変異を入れました。その後、交配してヘテロ接合(遺伝子のコピーの片方だけが変異で、もう片方は正常な状態です。劣性の病気では症状が出ないことも多いです。)体の系統を作り、さらに交配してホモ接合(同じ遺伝子について、両方のコピーが同じ変異を持つ状態です。劣性の病気では、この状態で症状が出やすいです。)体を得ようとしました。
遺伝子型は尾びれの一部からDNAを取り出してPCR(特定のDNA領域だけを大量に増やす実験方法で、遺伝子型の確認などに使います。)で増やし、サンガーシーケンス(DNAの塩基配列を正確に読むための方法で、変異が本当に入っているかの確認に使われます。)で変異を確認して判定しました。
遺伝子の発現量は公開されているRNA-seq(細胞や組織で作られているRNAをまとめて読み取り、どの遺伝子がどれくらい発現しているかを調べる方法です。)データを使い、臓器ごとの発現をTPM(RNA-seqの結果を比べやすくするための発現量の指標で、遺伝子の長さや読み取り数の違いを補正して表します。)でまとめました。若い個体での発現場所はin situ hybridization(組織の中で特定のmRNAがどこにあるかを、標識した探針で見えるようにする方法です。遺伝子がどの場所で使われているかがわかります。)で調べました。
組織の観察では、成体ホモ接合変異体1匹と同じ年齢の野生型1匹を固定し、薄い切片を作ってHE染色(組織の基本的な形を観察するための代表的な染色で、細胞や組織の状態を広く確認できます。)、azan染色(結合組織や線維化の程度を見やすくする染色方法で、臓器が固くなる変化の評価に使われます。)、Prussian blue染色(組織にたまった鉄を染めて見つける方法で、鉄沈着の有無を調べるのに使います。)で評価しました。
ただし、成体まで生きたホモ接合体が1匹しかいなかったため、qPCRやWestern blottingのような定量的な実験や、十分な再現実験が難しかったことが限界として述べられています。

この研究は、slc25a20の機能が失われたゼブラフィッシュ(小型の魚で、遺伝子操作がしやすく子どもが多く生まれるため、ヒトの病気研究のモデル生物としてよく使われます。)が、CACT欠損症(CACTが遺伝子の異常でうまく働かず、長鎖脂肪酸からのエネルギー産生が弱くなる病気です。心臓や筋肉、肝臓に強い影響が出やすく、新生児期に重症化することがあります。)を体の中で再現するモデルとして役立つ可能性があると結論づけています。ホモ接合(同じ遺伝子について、両方のコピーが同じ変異を持つ状態です。劣性の病気では、この状態で症状が出やすいです。)体が強い致死性を示し、まれに生き残った個体で心臓や骨格筋を中心にヒトの病気に似た組織変化が見られたことが根拠です。
一方で、成体まで生きたホモ接合体が1匹のみであることや、いつの時点で死に至るのかが未解明なこと、CRISPRの狙い以外の変化を完全には否定できないことなど、大きな制約があるとも示されています。それでも、希少疾患の研究に必要なモデル不足を補う手がかりとして重要だとされています。

このモデルを使って、患者で行われる食事療法（長鎖脂肪を減らす、高炭水化物にする、MCTやtriheptanoin(特殊な中鎖の脂肪（3本の7炭素脂肪酸からなる油）で、脂肪代謝の病気でエネルギーを補う目的で使われることがあります。)を補うなど）を評価し、より良い治療の組み合わせを探せる可能性が述べられています。またL-carnitine(脂肪酸をミトコンドリアへ運ぶときに必要になる物質で、脂肪からエネルギーを作る流れを助けます。治療として補充が検討されることがあります。)補充が心臓に悪影響を与えるかどうかという議論に対して、データを出せるかもしれないとしています。
さらに、孵化前の胚を使った薬剤スクリーニングで、病気の状態を改善する物質を探し、将来的には胎児期治療の考え方につながる可能性も挙げています。
加えて、発生のいろいろな段階で遺伝子型を調べ、ホモ接合(同じ遺伝子について、両方のコピーが同じ変異を持つ状態です。劣性の病気では、この状態で症状が出やすいです。)体がいつ死亡するのかを特定し、死亡直前の組織変化を調べて病気の進み方を整理することが勧められています。
最後に、今回の変異は重すぎて解析が難しいため、より軽症で生き残りやすい別の変異系統を作り、遅発型のヒトに近いモデルも目指すことが提案されています。