Integrating Biofertilizers with Organic Fertilizers Enhances Photosynthetic Efficiency and Upregulates Chlorophyll-Related Gene Expression in Rice

本論文は、気候変動と世界的な食料需要の増大という二重の圧力、とりわけ米が主食であるアジアにおける状況を背景としている。著者らは、米の増産は環境負荷を低減する方法で達成されなければならないと主張する。なぜなら、農業は気候変動の影響を受ける一方で、温室効果ガス排出や、持続不可能な投入資材に関連する土壌劣化を通じて、気候変動にも寄与するからである。著者らは収量改善の重要なてこ（レバレッジポイント）として光合成効率を位置づけ、光合成はクロロフィル合成、色素蓄積、エネルギー変換に関わる遺伝子によって厳密に制御されていることを強調する。バイオ肥料（biofertilizers）と有機肥料（organic fertilizers）は、合成肥料に代わる気候変動対応型（climate-smart）の選択肢として広く推奨されているが、著者らは特定の知識ギャップとして、「バイオ肥料を有機肥料と統合して施用した場合に、イネにおける光合成パフォーマンスおよびクロロフィル関連遺伝子の発現がどのように変化するのか」が十分に分かっていない点を挙げる。そこで本研究は、併用施用がイネの生育と生理機能に相乗的な改善をもたらすか、またその改善がクロロフィル生合成および光合成に関連する遺伝子群の測定可能な転写レベル変化を伴うかを検証することを目的とする。

生育形質および生理形質を通して、有機肥料＋バイオ肥料の併用処理（OF + BF）が一貫して最も高い成績を示した。対照（CNT）と比べて、OF + BFでは草丈が約90 cmに増加し（CNTの68 cmに対して31%高い）、分げつ数は8から18へ増加した（135%増）。群落の活力とクロロフィル状態の指標も改善し、NDVIは約0.73に達し（CNT 0.42に対して74%増と報告）、SPADは約33からほぼ47へ上昇した（42%増）。光合成色素の測定でもOF + BFで大きな増加がみられ、chlorophyll a（約0.45 mg/g fresh weight；CNTより66%高い）、chlorophyll b（約0.22 mg/g；CNTより72%高い）、total chlorophyll（約2.6 mg/g；CNTより67%高い）、β-carotene（約0.11 mg/g；CNTより50%高い）、lutein（約0.14 mg/g）、β-carotene + lutein（約0.25 mg/g；CNTより58%高い）が報告された。開花期のガス交換データでは、OF + BFで純光合成速度が顕著に高く（An = 48.23 μmol CO2 m⁻2 s⁻1；CNTの27.68に対して74%高い）、気孔コンダクタンスも高かった（1.14 mmol H2O m⁻2 s⁻1と報告；CNTより81%高い）。さらに、蒸散も高く（6.53 μmol H2O m⁻2 s⁻1；CNTより39%高い）、水利用効率も高かった（7.72 μmol CO2 mmol⁻1 H2O；CNTより30%高い）。多変量解析（PCAおよびhierarchical clustering）では、OF + BF（およびある程度RS + BF）がCNT/RS/DABFから分離され、形質全体にわたる広範な改善と整合していた。遺伝子発現レベルでは、一様な上方制御ではなく遺伝子ごとの応答が示され、OF + BFはOsChlDを顕著に増加させ（CNT比4.4倍）、OsCHLMも同様に増加したと記述された。一方で、OsChlおよびOsCHLGは、OF + BFでは他のいくつかの処理より低く、また光合成／葉緑体関連遺伝子の一部（例：OsTLP27、OsLHCB3）は、施肥した多くの処理よりもCNTで高い発現を示した。著者らはこれらのパターンを、OF + BFで見られたクロロフィル蓄積と光合成の改善が、測定対象の全遺伝子の広範な転写レベル上昇ではなく、クロロフィル生合成経路の一部の選択的活性化と同時に起きていることを示す証拠として解釈している。

本研究は、日本の柏崎市にあるKariwa Village Advanced Agro-Biotechnological Research Centreの制御型バイオトロン施設において、ポット試験として実施された。環境条件は28 °C/23 °C（昼/夜）、相対湿度70%、周囲CO2約400–450 ppmに設定された。土壌は柏崎の水田から（深さ0–20 cm）採取し、均質化、風乾、ふるい分け（2 mm）を行い、特性（N 27 mg/kg、P 37 mg/kg、K 74 mg/kg、EC 33.5 S/m、pH 5.68）を測定した。供試イネはOryza sativa ssp. japonica cv. Koshihikariで、種子を2日間浸漬し、2週間生長室で育苗した後に温室条件へ移し、30日齢の苗をポットへ移植した（1ポット当たり土壌4 kg）。試験は3反復の完全無作為化配置（completely randomized design）と記載され、各処理に5ポットを割り当て、測定には3個体を選抜した。処理は8区で、CNT、BF、deactivated biofertilizer（DABF）、rice straw（RS）、RS+BF、organic fertilizer（OF）、OF+BF、inorganic fertilizer（IOF）を設定した。バイオ肥料はTokyo8（Pseudomonas種に富むと報告される微生物活性剤）で、メーカー指示に従い施用した（1 mLを100 mLの水に希釈し、1ポット当たり20 mL）。RSとOF（lactic acid、eggshells、linsan guano excrete、rice flourを含む混合物）は地域から調達し、施用スケジュールと量はTable S1を参照した。ポットは水田条件を模すため湛水管理とし、土壌表面上約10 cmの水深を維持した。生育形質（草丈、分げつ数）は分げつ期（30DAG）に測定した。群落の活力はGreenSeekerセンサーでNDVIを測定し、クロロフィル状態はSPAD値で評価した。開花期にガス交換をLI-6400XL（CO2 400 μmol mol−1、PPFD 1200 μmol m−2 s−1、葉温26 °C）で測定し、An、gs、E、Ci、Ci/Caを記録し、WUEはAn/Eとして算出した。光合成色素はメタノール抽出（95% methanol、暗所で>24 h）後、655、645、495、480 nmで分光測定し、chlorophyll a、chlorophyll b、total chlorophyll、β-carotene、luteinを算出した。遺伝子発現は分げつ期に測定し、TRIzolによるRNA抽出、cDNA合成、RT-qPCR（CFX96 system；EvaGreen chemistry）を行い、OsUBQ5で正規化し、2−ΔΔCT法で解析した。統計解析はANOVAとTukey HSD（p < 0.05）に加え、RStudioで指定のパッケージ／関数を用いてPCAおよび二方向hierarchical clustering（heatmap）を実施した。

著者らは、バイオ肥料と有機肥料の統合（OF + BF）がイネに相乗的な利益をもたらし、栄養成長、クロロフィル／色素の蓄積、光合成パフォーマンスを、単独施用よりも強く、また多くの指標では無機肥料よりも強く改善すると結論づけた。OF + BFの優れた成績は、有機資材が土壌条件と微生物活性を支え、バイオ肥料が養分の可給性と吸収を高めるという統合的養分管理（integrated nutrient management）の機構と整合すると解釈している。重要な点として、本論文は生理学的な結果を転写レベルの変化と結び付け、OF + BFが特定のクロロフィル生合成遺伝子（とくにOsChlDとOsCHLM）を上方制御し、これがクロロフィル含量と純光合成の増加を支持すると著者らは主張する。同時に、OF + BF下でクロロフィルおよび光合成関連遺伝子のすべてが増加したわけではないことも強調し、一様な遺伝子誘導ではなく、経路の選択的活性化および／またはフィードバック制御による調節を示唆している。より広い文脈では、本研究はOF + BFを合成肥料への依存を低減しうる持続可能な代替策として位置づけ、生産性向上による食料安全保障のSDG 2および、環境負荷の小さい養分管理によるSDG 13に整合しうるとしつつ、証拠は制御されたポット条件に基づくことを認めている。

本論文は、将来研究の必要性を形作る限界を明確に述べている。実験は制御された気候チャンバー内のポット栽培で行われたため、土壌の不均一性、天候変動、その他の生態学的相互作用によって施肥反応が変化しうる圃場条件には、結果が完全には当てはまらない可能性があると著者らは注意を促す。また、実験期間が単一の作期に限られており、有機資材やバイオ肥料の効果の中心となる、分解動態や土壌性質の長期的変化といったより遅い過程を捉えるには短すぎる可能性があることも強調している。そのため、複数作期にわたる試験への拡張と、異なる農業生態区（agroecological zones）での検証を提案し、土壌と植物の生産性の両面で、観察された利益の持続性と一般化可能性を評価すべきだとしている。こうした将来研究は、持続可能な稲作体系においてバイオ肥料と有機肥料を統合する手法のスケール化と現実世界での適用可能性を評価するために必要だ、と位置づけられている。

この研究は、気候変動(地球の気温上昇や異常気象など、長い期間で気候のパターンが変わることです。農業は天候に左右されやすいため、作物の収量や品質に大きく影響します。)が進むことと、世界で食べ物の需要が増えていくことの両方が同時に起きている状況を背景にしています。特に、米を主食とするアジアでは、米をもっと生産する必要があります。
ただし、米を増産するときは、環境への負担をできるだけ小さくする方法で行うべきだと研究者は考えています。農業は気候変動の影響を受けるだけでなく、温室効果ガス(二酸化炭素やメタンなど、地球の熱を閉じ込めて温暖化を進める気体です。農業では水田からのメタンや、肥料由来のガスが問題になります。)の排出などを通して気候変動を進めてしまう面もあるからです。

研究者は、収量を増やすための重要なポイントとして「光合成の効率」に注目しました。光合成は、葉の色のもとになるクロロフィル(葉を緑に見せる色素で、光合成で光を集める中心的な役割を持ちます。量が多いと光を受け取る力が高まりやすいです。)などの合成に関わる遺伝子によって細かく調整されています。
近年、合成肥料の代わりとしてバイオ肥料(微生物の力を利用して、植物が養分を吸収しやすくしたり成長を助けたりする資材です。窒素を利用しやすくする菌や、リンを溶かして使いやすくする菌などが関わります。)や有機肥料(植物や動物由来の材料から作られる肥料です。土の性質を改善したり、養分をゆっくり供給したりする特徴があります。)がすすめられていますが、「バイオ肥料と有機肥料を一緒に使ったとき、イネの光合成の働きや、クロロフィルに関係する遺伝子の働きがどう変わるのか」は十分に分かっていませんでした。そこでこの研究では、両方を組み合わせて使うとイネの成長や体のはたらきがより良くなるのか、さらにその変化が遺伝子の働き方の変化として測定できるのかを調べました。

いろいろな測定結果をまとめると、有機肥料(植物や動物由来の材料から作られる肥料です。土の性質を改善したり、養分をゆっくり供給したりする特徴があります。)とバイオ肥料(微生物の力を利用して、植物が養分を吸収しやすくしたり成長を助けたりする資材です。窒素を利用しやすくする菌や、リンを溶かして使いやすくする菌などが関わります。)を組み合わせた処理（OF + BF）が、全体として最も良い結果になりました。
何も施肥しない対照区（CNT）と比べて、OF + BFでは草丈が約90cmまで伸び、茎の数（分げつ数）も8本から18本へ大きく増えました。

葉の元気さやクロロフィル(葉を緑に見せる色素で、光合成で光を集める中心的な役割を持ちます。量が多いと光を受け取る力が高まりやすいです。)の状態を示す指標でも改善が見られ、NDVI(植物の元気さを、光の反射のしかたから数値化する指標です。値が高いほど葉がよく茂り、健康である可能性が高いと考えられます。)やSPAD値(葉のクロロフィル量の目安を、専用の測定器で数値として示したものです。葉の緑の濃さに近い情報が得られます。)が上がりました。さらに、葉の中の光合成に関わる色素（クロロフィルa・b、総クロロフィル、βカロテン、ルテインなど）も、OF + BFで増えていました。

開花期に光合成の働きを測ると、OF + BFでは純光合成速度(光合成による二酸化炭素の吸収から、呼吸による放出を差し引いた「実質的に増えた分」の速さです。植物がどれだけ物質を作れているかの重要な指標です。)が大きく上がり、気孔コンダクタンス(気孔がどれくらい開いていて、二酸化炭素や水蒸気が出入りしやすいかを表す値です。光合成と水分の損失のバランスに関わります。)や蒸散(葉から水が水蒸気として出ていくことです。水の吸い上げや葉の温度調整に関係しますが、増えすぎると水不足の原因にもなります。)、水利用効率(失った水の量に対して、どれだけ二酸化炭素を取り込めたかを示す指標です。水が限られる環境で作物を育てるうえで重要です。)も高くなりました。つまり、光合成で二酸化炭素を取り込む力が強く、水の使い方も効率的になったと考えられます。

一方、遺伝子の発現は「全部の遺伝子が一斉に増える」という単純な変化ではありませんでした。OF + BFでは、クロロフィル合成に関わる一部の遺伝子（例：OsChlD、OsCHLM）が増えましたが、別の遺伝子（例：OsChl、OsCHLG）や、光合成や葉緑体(植物細胞の中にある、光合成を行う器官です。クロロフィルなどがここに集まっています。)に関係する遺伝子の中には、対照区のほうが高いものもありました。研究者は、OF + BFで光合成が良くなったのは、関連遺伝子が全体的に増えたからではなく、クロロフィル合成の流れの中の重要な部分が選んで強く働いた可能性があると考えています。

実験は日本の柏崎市にある研究施設で、ポット栽培によって行われました。温度や湿度、二酸化炭素濃度などを一定に保てる設備で、昼28℃・夜23℃、湿度70%などの条件に設定しました。

土壌は水田から採取してふるいにかけ、性質（窒素・リン・カリウム量、pHなど）を調べました。イネはコシヒカリを使い、苗を育ててからポットに植えました。

処理区は8種類で、無施肥（CNT）、バイオ肥料(微生物の力を利用して、植物が養分を吸収しやすくしたり成長を助けたりする資材です。窒素を利用しやすくする菌や、リンを溶かして使いやすくする菌などが関わります。)（BF）、微生物の働きを止めたバイオ肥料（DABF）、稲わら（RS）、稲わら＋バイオ肥料（RS+BF）、有機肥料(植物や動物由来の材料から作られる肥料です。土の性質を改善したり、養分をゆっくり供給したりする特徴があります。)（OF）、有機肥料＋バイオ肥料（OF+BF）、無機肥料(化学的に作られた肥料で、窒素・リン・カリウムなどがすぐ効きやすいのが特徴です。一方で使い方によっては環境への影響が大きくなることがあります。)（IOF）を比べました。水田に近い環境をつくるため、ポットは水を張った状態で管理しました。

草丈や分げつ数、NDVI(植物の元気さを、光の反射のしかたから数値化する指標です。値が高いほど葉がよく茂り、健康である可能性が高いと考えられます。)、SPADを測定し、開花期には装置でガス交換(葉が二酸化炭素を取り込み、酸素や水蒸気を出す動きのことです。光合成の強さや水の使い方を理解するのに役立ちます。)（光合成や蒸散(葉から水が水蒸気として出ていくことです。水の吸い上げや葉の温度調整に関係しますが、増えすぎると水不足の原因にもなります。)など）を測りました。葉の色素は抽出して濃度を測定しました。遺伝子の発現は葉からRNA(遺伝子（DNA）の情報をもとに作られ、タンパク質を作るための設計図のような役割を持つ分子です。遺伝子発現を調べるときに測定対象になります。)を取り出し、RT-qPCR(特定の遺伝子由来のcDNAを増やしながら量を測定し、遺伝子発現の違いを数値化する方法です。どの遺伝子がどれだけ働いているかを比較できます。)という方法で調べました。統計解析では、平均との差が偶然ではないかを判定する検定や、PCA(たくさんの測定項目をまとめて整理し、処理区の違いが見えやすい形にする分析方法です。似た特徴の処理は近くにまとまりやすくなります。)などの解析を行いました。

研究者は、有機肥料(植物や動物由来の材料から作られる肥料です。土の性質を改善したり、養分をゆっくり供給したりする特徴があります。)とバイオ肥料(微生物の力を利用して、植物が養分を吸収しやすくしたり成長を助けたりする資材です。窒素を利用しやすくする菌や、リンを溶かして使いやすくする菌などが関わります。)を組み合わせる方法（OF + BF）が、イネの成長、クロロフィル(葉を緑に見せる色素で、光合成で光を集める中心的な役割を持ちます。量が多いと光を受け取る力が高まりやすいです。)などの色素の増加、光合成の能力を、単独で使うよりも強く高めると結論づけました。多くの指標では、無機肥料(化学的に作られた肥料で、窒素・リン・カリウムなどがすぐ効きやすいのが特徴です。一方で使い方によっては環境への影響が大きくなることがあります。)よりも良い結果でした。
この理由として、有機肥料が土壌環境や微生物の活動を支え、バイオ肥料が養分を植物が使いやすい形にしたり吸収を助けたりすることで、全体として効果が高まった可能性が示されています。

また、光合成の改善と遺伝子の発現変化を結びつけて説明した点が重要です。OF + BFでは特定のクロロフィル関連遺伝子（特にOsChlDやOsCHLM）が増えており、これがクロロフィル量や純光合成速度(光合成による二酸化炭素の吸収から、呼吸による放出を差し引いた「実質的に増えた分」の速さです。植物がどれだけ物質を作れているかの重要な指標です。)の増加につながった可能性があると述べています。ただし、すべての関連遺伝子が増えたわけではなく、植物の中で「必要な部分だけが強く働く調整」が起きていることも示されました。
さらにこの研究は、合成肥料への依存を減らしつつ生産性を上げる方法として、食料問題や気候変動(地球の気温上昇や異常気象など、長い期間で気候のパターンが変わることです。農業は天候に左右されやすいため、作物の収量や品質に大きく影響します。)対策にも関係すると位置づけています。ただし、結果はポットでの管理された条件で得られたものだとも認めています。

この実験は環境を一定にしたポット栽培で行われたため、実際の田んぼのように土の状態が場所によって違ったり、天候が変化したりする条件では、同じ結果にならない可能性があります。
また、実験が1作だけだったため、有機肥料(植物や動物由来の材料から作られる肥料です。土の性質を改善したり、養分をゆっくり供給したりする特徴があります。)や稲わらが分解して効いてくるような長い時間がかかる変化や、土壌が長期的にどう変わるかまでは十分に追えない可能性があります。
そのため今後は、複数年にわたる試験や、地域や環境条件が異なる場所での検証を行い、この方法の効果が長く続くのか、どこでも通用するのかを確かめる必要があるとしています。