初期エナメルう蝕病変に対する歯面被覆材料の抗バイオフィルム効果および歯面脱灰抑制効果

う蝕（dental caries）の予防には、う蝕原性バイオフィルムを抑えることと、カルシウム（Ca）およびリン酸（P）イオンが局所に存在することによってエナメル質の再石灰化を促進することの両方が重要であり、鉱物とフッ化物の相互作用によって脱灰を減らせることから、フッ化物はゴールドスタンダードとみなされている。しかし、唾液環境は動的であるため、フッ化物はエナメル質上での保持が不十分となり効果が限定される可能性があり、また過剰なフッ化物使用は毒性を有する。このため、歯面での保護効果を長持ちさせる、あるいは局在化させる方法が求められている。近年開発された歯科用コーティング材料は、主として象牙質知覚過敏を目的としているが、イオン放出フィラーや機能性モノマーを含み、再石灰化やバイオフィルム制御に寄与すると期待されている。一方で、これらのコーティングが初期エナメル質病変に及ぼす作用機序や相対的効果は十分に明らかではない。そこで本研究では、活性成分の異なる3種類の材料—PRG Barrier CoatTM（PRG）、BioCoat CaTM（BioC）、およびFluorDental JellyTM（FluorJ；2% sodium fluoride、9000 ppmを陽性対照として使用）—を評価し、modified Robbins device（MRD）フローセルシステムを用いた初期エナメル質病変モデルにおいて、Streptococcus mutansバイオフィルム形成の抑制能と脱灰抑制能を検討した。

すべての群で24時間後にS. mutansバイオフィルムが形成されたが、バイオフィルムの構造と細菌の生存性は材料によって異なった。SEMおよびCLSMでは、FluorJがバイオフィルムの蓄積を著しく減少させ、PRGやBioCよりも疎で薄いクラスターと、より低いbiovolumeを示した。しかし、Live/Dead染色では、FluorJのバイオフィルム内に残存した細菌は概ね生存していた。定量的には、生菌数はすべての材料で各対応する対照（paired controls）より有意に減少し、差が最も大きかったのはBioC（p < 0.0001）、次いでFluorJ（p < 0.001）、PRGは差が小さいものの有意（p < 0.05）であった。生菌数については、BioCとFluorJはいずれも同程度に低い水準に達し、それぞれの対照のおよそ1/1000であった。これに対し、総菌数はすべての材料で対照より減少したものの、有意な減少を示したのはFluorJのみ（6.43 ± 0.40 vs 7.66 ± 0.30 log copies；p < 0.01）であり、FluorJは生存性低下に加えてバイオフィルム蓄積自体も抑制したことが示された。酸産生および耐酸性のアッセイでは、遺伝子発現の変化がみられたにもかかわらず、処理条件と対照条件の間に有意差は認められなかった（p > 0.05）。qPCRでは、FluorJがバイオフィルム形成、付着、耐酸性、酸産生に関連する遺伝子を広範にダウンレギュレーションし（gtfC以外の検討対象遺伝子すべて）、一方BioCとPRGはより選択的で、全体として小さいダウンレギュレーションパターンを示した。EPMAマッピングから、脱灰したエナメル質へのイオン取り込みは元素と材料に依存することが示唆された。PRGでは複数のイオンの取り込みが可能であったが、FとAlは表層エナメル質に限定され、Bの取り込みは認められなかった。FluorJではフッ化物の取り込みがみられ、BioCではバイオフィルム／コーティング界面の下にあるエナメル質へのCaの取り込みが特異的に観察された。さらに、マッピングパターンは、すべてのコーティングがバイオフィルム関連の酸負荷に対する抵抗性を付与していることも示唆し、物理的バリア効果と整合した。

ウシ上顎中切歯73本から、長方形のエナメル質ブロック（5 mm × 5 mm × 4 mm）をペア検体として作製し、表面を標準化するため研磨した後、2.5% NaOClで短時間脱タンパク処理し、洗浄した。人工的な初期エナメル質病変は、エナメル質以外の表面をマニキュアで保護し、脱灰溶液（2.2 mM calcium chloride、2.2 mM sodium phosphate、0.05 M acetic acidを1 M potassium hydroxideで調整；pH 4.4）に37 ◦Cで72時間浸漬して作製し、溶液は24時間ごとに交換した。各ペアは3材料（PRG、BioC、FluorJ）のいずれかに割り付け、一方をメーカー手順に従って処理し、もう一方を対応する未処理対照とした。バイオフィルムはMRD連続フローシステムで培養した。まず、希釈・清澄化・フィルター滅菌した非刺激唾液（Ringer溶液に0.05% cysteineを加え、1:10に希釈）から調整唾液ペリクルを、フロー（2 mL/min）下で形成した後に静置した。次に、S. mutans UA159（OD600 = 0.05）を導入し、初期付着（静置30分）の後、1/10 BHI + 0.05% sucrose（pH 7.4）を連続フロー（2 mL/min）で24時間、37 ◦C・嫌気条件下で供給した。評価項目は、SEM画像、CLSMによるLive/Dead画像（8 μmの垂直凍結切片；各群3反復）、バイオフィルム剥離後（超音波処理／振とうプロトコル）の生菌コロニー数、DNA抽出後にmodified Invader PLUS assayで測定した総菌数、残存細胞のATPバイオルミネッセンス、CAT21スコアによる48時間の酸産生能（acidogenicity）、pH 4.5–7.4のBHIで培養後のOD600による耐酸性、ならびにRT-qPCR（6反復；16S rRNAで正規化）によるバイオフィルム／付着および酸関連遺伝子の転写プロファイルであった。エナメル質のイオン分布と脱灰パターンはEPMA元素マッピング（F、Al、Si、Sr、Caを含む）で評価した。各材料と対応する対照の統計比較にはKruskal–Wallis検定とSteel–Dwass事後検定を用いた（p < 0.05）。

連続フロー下のin vitro初期エナメル質病変モデルにおいて、FluorJは総合的に最も強い抗バイオフィルム性能を示し、生菌量と総菌量が有意に低く、バイオフィルム蓄積も減少した。著者らはこれを、抗菌作用と細菌付着の低下の両方を反映するものと解釈している。これに対しPRGとBioCは、表面被覆レベルではバイオフィルム形成を防がなかったが、生菌数は有意に減少した一方で総菌数は有意に減少せず、バイオマス蓄積を必ずしも抑えない殺菌的作用を示唆した。EPMA所見は、PRGとBioCにおける第2の保護機序として、コーティングによる物理的バリアがバイオフィルム由来の酸へのエナメル質曝露を減らすこと、ならびに脱灰エナメル質へのイオン供給が起こることを支持した。加えてBioCでは、バイオフィルム／コーティング領域の下方へのCa取り込みがみられ、PRGでは複数イオンの取り込みがみられたものの、FとAlは主として表層エナメル質に限定され、Bの取り込みは検出されなかった。FluorJは多くの病原因子関連転写産物をダウンレギュレーションしたが、酸産生および耐酸性のアッセイは有意に変化せず、著者らはその理由として、フッ化物のバイオフィルム内への浸透が限定的であること、および／またはフロー下での洗い流し（washout）の可能性を挙げ、フッ化物の代謝への影響が材料表面近傍の細菌に局在する可能性を示唆している。総じて、本研究は、検討したすべてのコーティングがin vitroでは追加的な脱灰を抑制し得る一方で、抗バイオフィルム特性とイオン取り込みプロファイルは大きく異なり、臨床的意義は未解明であると論じている。

著者らは、PRGおよびBioCがin vitroで病変進行を防ぎイオンを供給できるにもかかわらず、従来のフッ化物使用を超える臨床的利点をもたらすかどうかを判断するには追加研究が必要だと強調している。また、コーティングによる耐酸性の持続性には不確実性があるとして、接着性またはコーティングのバリアが状況によっては酸攻撃による脱灰に十分耐えられない可能性や、放出される複数イオンの相互作用が予期しない影響を生む可能性を指摘している。フッ化物ベースのアプローチについては、抗バイオフィルム活性は塗布直後に最も強く、その後時間とともに弱まる可能性があること、さらに、フッ化物のバイオフィルム内への浸透が限られることや流体フロー下でのwashoutといった機序上の制約を挙げている。より広い観点では、初期エナメル質病変のミネラル化にとって「最適」な戦略は依然不明確であり、フッ化物はより耐酸性の高いミネラル形成を通じた病変停止の中心である一方、apatite結晶の成長を促進しない可能性があるため、病変部位での局所CaおよびP利用可能性を高めるアプローチへの関心が動機づけられるとしている。したがって著者らは、実臨床での利益、比較有効性、そしてPRGとBioCが確立したフッ化物応用に対してどの程度付加価値を提供し得るかを明確にするため、適切に設計された臨床研究を求めている。

むし歯を防ぐためには、歯の表面にできる「むし歯の原因になりやすい細菌のかたまり」を抑えることと、歯の表面（エナメル質(歯の一番外側にある硬い層です。むし歯ではここが最初に溶け始めます。)）を元に戻すための材料であるカルシウムやリン酸がその場所にあることの両方が大切です。
フッ化物(歯を酸に強くしたり再石灰化を助けたりする成分です。歯みがき粉やフッ素塗布などで使われます。)（フッ素）は、歯を溶けにくくしたり修復を助けたりする力が強いので、むし歯予防では標準的な方法と考えられています。けれども口の中は唾液で常に流れがあり、フッ化物が歯の表面にとどまりにくく、効果が十分に続かないことがあります。また、フッ化物を使いすぎると体に害が出る心配もあります。
そこで、歯の表面に「コーティング」をして保護効果を長持ちさせたり、必要な場所に成分をとどめたりする方法が注目されています。ただし、こうしたコーティング材が、むし歯の初期段階のエナメル質にどう働くのかは、まだよく分かっていません。
本研究では、成分の違う3つの材料（PRG、BioC、FluorJ）を比べ、初期のエナメル質病変のモデルで、むし歯菌（S. mutans）のバイオフィルム(細菌が歯の表面に集まり、ねばねばした物質と一体になって作るかたまりです。歯垢の強力な形だと考えると分かりやすいです。)をどれだけ抑えられるか、歯が溶けるのをどれだけ防げるかを調べました。

24時間後、どの条件でもS. mutansのバイオフィルム(細菌が歯の表面に集まり、ねばねばした物質と一体になって作るかたまりです。歯垢の強力な形だと考えると分かりやすいです。)はできましたが、材料によって様子が違いました。
FluorJは、バイオフィルムのたまり方を特に大きく減らし、薄くてまばらな状態になりました。ただし、FluorJの上に残った細菌は、生きているものも多く見られました。
数を測ると、生きている細菌の数はどの材料でも減りましたが、減り方が特に大きかったのはBioC、次がFluorJで、PRGは減るものの差は小さめでした。BioCとFluorJでは、生きている細菌数がそれぞれ対照の約1000分の1まで下がりました。
一方で、細菌の総数（生死を問わない数）がはっきり減ったのはFluorJだけで、FluorJは「細菌を減らす」だけでなく「バイオフィルム自体をたまりにくくする」働きも強いことが示されました。
細菌が酸を作る力や酸に耐える力については、遺伝子の働き方に変化が見られたのに、実際の測定では材料あり・なしで大きな差は確認できませんでした。
歯の中へのイオン(電気的な性質をもった原子や分子で、カルシウムイオンやフッ化物イオンのように歯の修復や性質に影響します。)の入り方は材料によって違い、PRGは複数のイオンが入る可能性がありましたが、フッ素やアルミニウムは表面近くに限られ、ホウ素は取り込みが確認できませんでした。FluorJではフッ素が取り込まれ、BioCではコーティングの下のエナメル質(歯の一番外側にある硬い層です。むし歯ではここが最初に溶け始めます。)にカルシウムが入る様子が特徴的に見られました。
また、どのコーティングも、バイオフィルムが作る酸による追加のダメージを受けにくくしている可能性が示され、物理的な「壁」としての効果が考えられました。

ウシの前歯から同じ大きさのエナメル質(歯の一番外側にある硬い層です。むし歯ではここが最初に溶け始めます。)ブロックを作り、表面を整えた後、人工的に「初期むし歯に近い状態（初期エナメル質病変(むし歯の初期段階で、まだ穴があいていない状態です。再石灰化で回復できる可能性があります。)）」を作りました。
それぞれのブロックをペアにし、片方に材料（PRG、BioC、FluorJのいずれか）を塗り、もう片方は塗らない対照にしました。
その後、MRDという装置で、唾液に近い条件を作りながらS. mutansのバイオフィルム(細菌が歯の表面に集まり、ねばねばした物質と一体になって作るかたまりです。歯垢の強力な形だと考えると分かりやすいです。)を24時間育てました。
評価は、顕微鏡での観察、生きた菌の数と総菌数の測定、酸を作る力・酸に耐える力の測定、遺伝子の働き方の測定、さらにEPMA(歯の断面にどの元素がどこにあるかを地図のように示す分析法です。材料から出たイオンが歯に入ったかどうかを調べられます。)で歯の中のイオン(電気的な性質をもった原子や分子で、カルシウムイオンやフッ化物イオンのように歯の修復や性質に影響します。)分布を調べる方法で行いました。

この実験条件では、FluorJが最も強くバイオフィルム(細菌が歯の表面に集まり、ねばねばした物質と一体になって作るかたまりです。歯垢の強力な形だと考えると分かりやすいです。)を抑え、生きている菌も総数も減らし、バイオフィルムのたまり方自体も減らしました。これは、殺菌作用だけでなく、細菌が歯にくっつくのを弱めた可能性があると考えられます。
一方、PRGとBioCは、バイオフィルムの形成そのものを大きく止めるとは言いにくいものの、生きている菌の数は減らしました。また、コーティングが物理的な壁になって酸の影響を弱めたり、材料によっては歯にイオン(電気的な性質をもった原子や分子で、カルシウムイオンやフッ化物イオンのように歯の修復や性質に影響します。)を供給したりすることで、歯が溶けるのを追加で進ませにくくする可能性が示されました。
ただし、材料ごとに「バイオフィルムへの効き方」や「歯へのイオンの入り方」が大きく違い、実際の治療でどれほど役立つかは、まだはっきりしないとまとめています。

PRGやBioCは実験室の条件では病変の進行を防いだりイオン(電気的な性質をもった原子や分子で、カルシウムイオンやフッ化物イオンのように歯の修復や性質に影響します。)を供給したりできましたが、普段のフッ化物(歯を酸に強くしたり再石灰化を助けたりする成分です。歯みがき粉やフッ素塗布などで使われます。)の使い方より明確に良いのかどうかは、追加の研究が必要です。
また、コーティングの耐久性が十分か、状況によっては酸の攻撃に負けないか、複数のイオンが出ることで予想外の影響が起きないか、といった点も課題です。
フッ化物についても、塗った直後が最も効いて、その後弱まる可能性や、バイオフィルム(細菌が歯の表面に集まり、ねばねばした物質と一体になって作るかたまりです。歯垢の強力な形だと考えると分かりやすいです。)の奥まで入りにくいこと、唾液の流れで成分が流されることなどの限界が考えられます。
さらに大きな視点では、初期のエナメル質(歯の一番外側にある硬い層です。むし歯ではここが最初に溶け始めます。)病変を最も良い形で回復させる方法はまだ確立していません。フッ化物は重要ですが、それだけでは結晶の成長を十分に進めない可能性もあるため、病変部位でカルシウムやリン酸を増やす方法にも関心が集まっています。今後は、実際の患者さんでの効果を比べる臨床研究が求められます。