糖代謝とmTORC1との相互作用が、ALDH高活性の患者由来子宮体癌スフェロイド細胞の増殖に関与する

子宮内膜がんではPI3K–Akt–mTORC1経路の制御異常がしばしばみられ、ゲノム異常によりmTORC1が過剰に活性化していることが一般的である。この軸を標的とする阻害薬は臨床で試験されてきたものの、報告されている有効性は限定的であり、経路の制御を明確にし、どの患者が反応しうるかを同定する必要性が動機となっている。並行して、がん幹細胞様の集団が、侵襲的な病態の特徴や治療抵抗性を駆動すると考えられている。アルデヒド脱水素酵素（ALDH）は、特にこのがん種ではALDH1A1が、そのような幹細胞様細胞のマーカーおよび制御因子として機能する。患者由来の三次元スフェロイドモデルは臨床的に重要な特性を保持しうるため、薬剤感受性試験を支援する可能性がある。本研究は、(i) 患者由来の子宮内膜がんスフェロイド細胞および対応するxenograftにおけるPI3K–Akt–mTORC1阻害薬への応答の不均一性を特徴づけること、(ii) ALDHに関連する代謝（以前にGLUT1を介した解糖系との関連が示されている）とmTORC1シグナルの間の機序的なクロストークを定義し、侵襲性の高い子宮内膜がんにおける介入可能な脆弱性を同定すること、を目的とした。

スフェロイド系統全体で、PI3K–Akt–mTORシグナル活性のマーカー（例：phospho-Akt、phospho-PTEN、phospho-p70S6K）は変動し、ALDH1A1発現と単純には連動していなかった。臨床的に進行した35例では、phospho-p70S6K高発現が全生存期間と関連した（p = 0.04）が、無増悪生存期間とは関連せず、著者らはサンプルサイズの限界に言及している。薬剤試験では、PI3K阻害薬Alpelisibに対して異なる感受性群が認められ、in vitroの感受性はxenograftでの応答と一致し、増殖抑制はカスパーゼ活性化の増加を伴った。重要な点として、ALDH-high画分とALDH-low画分は変異プロファイルが類似しており、Alpelisib感受性も同程度で、さらにPI3K/Akt阻害はALDH活性を測定可能な範囲で変化させなかった。それでも、disulfiram（ALDH阻害薬）をAlpelisibまたはAkt阻害薬と併用すると、in vitroでスフェロイド増殖が加算的に抑制され、xenograft腫瘍サイズも低下した（試験モデルではAlpelisib単独に比べて約半減）。PI3K/Akt阻害薬と対照的に、mTOR阻害薬（everolimus、Torin1）は系統間でより一様な活性を示し、ALDH-high細胞はeverolimusにより高感受性であった。ALDH1A1の過剰発現はphospho-p70S6Kを増加させ、everolimus感受性も増加させた。機序面では、ALDH阻害はphospho-PI3K/phospho-Aktを低下させることなくphospho-p70S6Kを低下させ、GSEAによりALDH-high細胞が「hallmark mTORC1 signaling」と関連づけられた（FDR q-value < 0.01、NES 1.59、p-value < 0.01）。また、mTOR活性化薬（MHY1485）はdisulfiramの細胞傷害性を部分的に救済し、phospho-p70S6Kを回復させた。さらに本研究は、LDHAを重要な仲介因子として同定した。LDHAの発現と活性はALDH-high細胞で高く、ALDH1A1過剰発現はLDHAを増加させ、disulfiramはLDHAを低下させた一方、PI3K/Akt阻害薬はLDHAを変化させなかった。LDHA阻害（AZ-33）またはLDHAノックダウンは増殖を抑制し、phospho-p70S6Kを低下させ、幹細胞性（stemness）関連因子（Nanog、Oct-4、c-Myc）を減少させた。MHY1485はAZ-33の効果を部分的に逆転させた。臨床的には、ALDH陽性腫瘍細胞はALDH陰性細胞よりLDHA染色が強かった。244人の患者での血清LDHは、高悪性度および進行期で高値であった。TCGA解析では、高悪性度腫瘍でLDHA mRNAが高く、LDHA-high症例で全生存期間が不良であった（p = 0.02）。無増悪生存期間の短縮傾向もみられた（p = 0.09）。また、LDHAはRPS6KB1と相関した（p = 0.01）。最後に著者らは、解糖系とmTORC1の双方向の結合を報告している。everolimusはGLUT1レベルを増加させ、LDHA発現を変えないまま解糖系速度に影響した一方、MHY1485はGLUT1を低下させ、相互制御を支持した。

著者らは、患者由来の子宮内膜がんスフェロイド培養を用い、ultra-low-attachment条件下で、8 ng/mlのbasic fibroblast growth factorを添加したSTEMPRO hESC SFMで増殖させ、解離後に継代した。シグナル状態は、経路タンパク質のリン酸化体を対象とするウェスタンブロット、およびスフェロイド由来xenograft腫瘍と対応する原臨床検体における免疫組織化学（IHC）で評価した。さらに進行期組織35例でphospho-p70S6Kの追加IHCを行い、Kaplan–Meier生存解析（logrank検定）を実施した。変異プロファイルは、スフェロイドと原腫瘍の間、およびALDH-highとALDH-lowのスフェロイド画分間で、研究中に記載されたtargeted sequencingにより比較した。薬剤感受性はin vitroで検討し、PI3K阻害薬（Alpelisibに加えTaselisib、Copanlisib）、Akt阻害薬（Ipatasertib、Caplivasertib）、mTOR阻害薬（everolimus、Torin1）、ALDH阻害薬（disulfiram）、LDHA阻害薬（AZ-33）を単独および併用で用いた。増殖抑制条件下での細胞傷害性に関連する指標としてカスパーゼ活性化を用いた。in vivoでの検証にはNOGマウスの皮下xenograftを用い、スフェロイド由来単一細胞を50% Matrigelと混合し、群を無作為割り付け（n = 6または8）し、注入後10～20日から2～3日ごとに投与し、腫瘍を4～6週間モニタリングした。機序の撹乱として、レンチウイルスによるALDH1A1過剰発現（hygromycin選択）、薬理学的mTORC1活性化（MHY1485）、RNAiによるLDHAノックダウンを行った。トランスクリプトームの解釈には、マイクロアレイデータ（GEO: GSE123530）のGSEAと、ChIP-Atlas由来のRARA結合情報の統合を用いてRA制御下のmTORC1関連候補遺伝子を推定し、その後実験的に評価した。臨床関連解析には、IHCでの共分布パターン、244人の患者における施設内の血清LDH測定、TCGAに基づく生存および発現比較を含めた。実験データの統計検定は、F検定に応じてWelchのt検定またはStudentのt検定を用い、p < 0.05を有意とした。

本研究は、患者由来の子宮内膜がんスフェロイドがPI3K–Akt–mTOR経路阻害薬への反応性における臨床的に重要な不均一性を再現し、in vitroの薬剤感受性がxenograft応答を反映しうることを示し、機能的試験プラットフォームとしての利用を支持すると結論づけている。機序的には、著者らはALDH活性の高い幹細胞様スフェロイド細胞における増殖の中心的駆動因子として、ALDH–LDHA–mTORC1カスケードを提案する。この枠組みでは、ALDH活性（主としてALDH1A1に起因）が、PI3K/Aktの下流または独立してmTORC1活性化を促進し、少なくとも一部はレチノイン酸に関連したLDHAの発現上昇と活性化を介するとされる。LDHAは、mTORC1シグナル（phospho-p70S6Kに反映）と幹細胞性関連因子を支え、その阻害はmTORC1阻害の一部の側面を再現する。本研究はさらに、mTORC1活性と解糖系制御（GLUT1を介する）の相互結合を強調し、ALDH活性細胞では代謝状態とmTORC1シグナルが相互に強化し合うことを示唆する。臨床的には、LDHA/LDHの指標が高悪性度、進行期、ならびに不良な生存シグナルと関連し、LDHAが侵襲的な病態生物学に結びつく潜在的バイオマーカーとなりうる位置づけが示された。治療面では、ALDH阻害をPI3KまたはAkt阻害薬と併用することで加算的な増殖抑制が得られること、そしてLDHAとmTORC1がこの子宮内膜がんの文脈で相互に関連した脆弱性であることが強調される。

著者らは、侵襲性の高い子宮内膜がんにおいて、ALDH–LDHA–mTORC1カスケードおよび解糖系とmTORC1のフィードバック関係をさらに検討し、これらの機序的知見を臨床戦略へと翻訳する必要があると述べている。mTORC1シグナルとALDHの影響を受ける解糖系の相互作用を標的化することで、新たな治療アプローチが開け、ゲノム異常により反応パターンが複雑な場合でもPI3K/Akt経路阻害を補完しうる可能性があるとしている。議論ではまた、患者由来スフェロイドモデルが治療感受性の予測に臨床的有用性を持つ可能性、特に変異プロファイル（例：PTEN関連のベースラインAkt活性、PIK3CA変化）が特定阻害薬への反応を層別化しうる点が強調されている。加えて、LDHA発現／血清LDHと不良な臨床特徴との関連が観察されたことから、子宮内膜がんにおけるバイオマーカー候補としてのLDHAについて、phospho-p70S6KなどのmTORC1活性マーカーとの関係も含めて継続的な評価が動機づけられる。

子宮内膜がん(子宮の内側を覆う膜（子宮内膜）から発生するがんで、進行すると治療が難しくなる場合があります。)では、細胞の増殖や生存を助けるPI3K–Akt–mTORC1(細胞が成長するためのタンパク質合成などを進める中心的な仕組みで、がんで過剰に働くと腫瘍が大きくなりやすくなります。)という仕組みがうまく制御できず、mTORC1が必要以上に働いてしまうことがよくあります。そのため、この仕組みを止める薬（阻害薬(特定の分子の働きを弱めたり止めたりする薬で、がん細胞の増殖シグナルを抑える目的で使われます。)）が試されてきましたが、効果は一部の患者さんに限られていました。そこで研究者たちは、どんな患者さんが薬に反応しやすいのかをもっとはっきりさせたいと考えました。
また、がんの中には「がん幹細胞(がんの中に少数存在し、自己複製してがんを作り続けたり、再発や治療抵抗性に関わったりすると考えられる細胞です。)のような性質」をもつ細胞集団がいて、がんが広がりやすくなったり、治療が効きにくくなったりする原因になると考えられています。子宮内膜がんではALDH(細胞内の有害な物質（アルデヒド）を分解したり、ビタミンA関連物質の代謝に関わったりする酵素で、がん幹細胞の目印として使われることがあります。)、特にALDH1A1がそのような細胞の目印（マーカー）や、働きを支える要素になりうることが知られています。
さらに、患者さんのがんから作った3Dのスフェロイド(がん細胞を立体的に集めた球状の細胞のかたまりで、体内の腫瘍に近い環境を再現しやすいモデルです。)（細胞のかたまり）は、実際のがんに近い特徴を保てるため、薬の効きやすさを調べるのに役立つ可能性があります。
この研究の目的は、主に次の2つです。
1つ目は、患者由来のスフェロイド細胞と、それをマウスに移植した腫瘍モデルで、PI3K–Akt–mTORC1を標的にする薬への反応がどれくらいバラバラかを調べることです。
2つ目は、ALDHに関係する代謝（以前にGLUT1(細胞がブドウ糖を取り込むための入口になるタンパク質で、解糖系を進めるうえで重要です。)を通じた解糖系(ブドウ糖からエネルギーを作る基本的な代謝経路で、がん細胞はこれを強く使うことが多いです。)との関係が示されている）と、mTORC1の信号がどう結びついているのかを明らかにして、悪性度が高い子宮内膜がんで狙える弱点を見つけることです。

スフェロイド(がん細胞を立体的に集めた球状の細胞のかたまりで、体内の腫瘍に近い環境を再現しやすいモデルです。)の種類ごとに、PI3K–Akt–mTORの働き具合を示す指標（phospho(タンパク質にリン酸が付いた状態を示し、スイッチが入って働いている目印として使われることが多いです。)-Aktなど）は大きく違いましたが、ALDH(細胞内の有害な物質（アルデヒド）を分解したり、ビタミンA関連物質の代謝に関わったりする酵素で、がん幹細胞の目印として使われることがあります。)1A1の多さと単純に一致するわけではありませんでした。臨床検体35例では、phospho-p70S6K(mTORC1が働いた結果として活性化しやすいタンパク質で、細胞の成長に必要なタンパク質合成を進めます。)が高い人ほど全生存期間(診断や治療開始から、亡くなるまでの期間のことです。)が短いことと関係していましたが、がんが悪化せずに過ごせる期間（無増悪生存期間(治療開始後、がんが悪化しないで過ごせた期間のことです。)）とははっきりした関係がなく、症例数が少ない点が限界として挙げられていました。
薬の実験では、PI3K阻害薬(特定の分子の働きを弱めたり止めたりする薬で、がん細胞の増殖シグナルを抑える目的で使われます。)Alpelisib(PI3Kを狙って抑える薬で、がんのタイプや遺伝子変異によって効きやすさが変わります。)に対して「よく効く群」「効きにくい群」などの差がありました。そして、試験管内での効きやすさは、マウスに移植した腫瘍での反応とも一致していました。増殖が抑えられるときには、細胞死に関係するカスパーゼ(細胞が自ら死ぬ仕組み（アポトーシス）で働く酵素で、活性が上がると細胞死が進んでいる目安になります。)の働きが増えていました。
重要な点として、ALDHが高い細胞（ALDH-high）と低い細胞（ALDH-low）は、遺伝子変異のパターンが似ていて、Alpelisibの効きやすさも同じ程度でした。また、PI3KやAktを止めてもALDH活性ははっきり変わりませんでした。
一方で、ALDH阻害薬disulfiram(もともと別の病気に使われる薬ですが、ALDHの働きを抑える作用があり、がん研究ではALDH阻害薬として使われます。)を、AlpelisibやAkt阻害薬(Aktというタンパク質の働きを止め、増殖シグナルを弱める薬です。)と一緒に使うと、スフェロイドの増殖がより強く抑えられ、マウスの腫瘍も小さくなりました（Alpelisib単独より腫瘍が約半分）。
PI3K/Akt阻害薬とは違い、mTOR阻害薬（everolimus(mTORC1を抑える薬で、mTORC1が強く働いているがんで効果が期待されます。)、Torin1(mTORを強く抑える研究用の薬の一つで、mTORC1の働きを下げる目的で使われます。)）はスフェロイド間で比較的安定して効き、ALDH-high細胞はeverolimusがより効きやすい傾向がありました。ALDH1A1を増やすとphospho-p70S6Kが増え、everolimusへの感受性も上がりました。
仕組みの面では、ALDHを阻害すると、PI3KやAktの指標を下げずにphospho-p70S6Kだけが下がりました。また、解析（GSEA(遺伝子の発現データをまとめて解析し、特定の働きに関係する遺伝子群が強いかどうかを調べる方法です。)）でもALDH-high細胞がmTORC1(細胞が成長するためのタンパク質合成などを進める中心的な仕組みで、がんで過剰に働くと腫瘍が大きくなりやすくなります。)関連の遺伝子セットと強く結びついていました。さらに、mTORを活性化する薬MHY1485は、disulfiramによる細胞へのダメージを一部打ち消し、phospho-p70S6Kも回復させました。
加えて、この研究はLDHA(乳酸を作る反応に関わる酵素の一部で、がんでは代謝を変えて増殖を助けることがあります。)がつなぎ役として重要だと示しました。LDHAはALDH-high細胞で高く、ALDH1A1を増やすとLDHAも増え、disulfiramでLDHAは下がりました。しかしPI3K/Akt阻害薬ではLDHAは変わりませんでした。LDHAを抑える（AZ-33(LDHAの働きを抑える薬で、LDHAに頼るがん細胞の増殖を弱める目的で使われます。)やノックダウン）と増殖が抑えられ、phospho-p70S6Kが下がり、幹細胞らしさに関係する因子（Nanogなど）も減りました。MHY1485はこの効果も一部戻しました。
臨床的にも、ALDH陽性のがん細胞はLDHAの染色が強い傾向がありました。244人の患者さんでは血清LDH(血液検査でも測られる酵素で、体内で細胞が壊れたり腫瘍が活発だったりすると高くなることがあります。)が、高悪性度や進行期で高値でした。TCGA(多くのがん患者さんの遺伝子や臨床情報を集めたデータベースで、予後との関係などの解析に使われます。)でも高悪性度でLDHA mRNA(遺伝子情報をもとにタンパク質を作るための設計図の写しで、量が多いとそのタンパク質が作られやすい傾向があります。)が高く、LDHAが高い患者さんは生存が悪い傾向がありました。
最後に、解糖系(ブドウ糖からエネルギーを作る基本的な代謝経路で、がん細胞はこれを強く使うことが多いです。)とmTORC1が互いに影響し合う関係も示されました。everolimusはGLUT1(細胞がブドウ糖を取り込むための入口になるタンパク質で、解糖系を進めるうえで重要です。)を増やして解糖系の動きに影響し、MHY1485はGLUT1を下げるなど、相互調整があることが示唆されました。

患者さんの子宮内膜がん(子宮の内側を覆う膜（子宮内膜）から発生するがんで、進行すると治療が難しくなる場合があります。)から作ったスフェロイド(がん細胞を立体的に集めた球状の細胞のかたまりで、体内の腫瘍に近い環境を再現しやすいモデルです。)細胞を、細胞が皿にくっつきにくい条件で培養し、増殖させました。PI3K–Akt–mTORC1(細胞が成長するためのタンパク質合成などを進める中心的な仕組みで、がんで過剰に働くと腫瘍が大きくなりやすくなります。)の状態は、タンパク質のリン酸化を調べる方法（ウェスタンブロット(細胞内のタンパク質量やリン酸化の状態などを調べる実験方法です。)）や、組織を染めて見る方法（IHC）で確認しました。進行例35例ではphospho(タンパク質にリン酸が付いた状態を示し、スイッチが入って働いている目印として使われることが多いです。)-p70S6K(mTORC1が働いた結果として活性化しやすいタンパク質で、細胞の成長に必要なタンパク質合成を進めます。)を追加で染色し、生存解析も行いました。
遺伝子変異はtargeted sequencingで比較しました。薬の効き方は、PI3K阻害薬(特定の分子の働きを弱めたり止めたりする薬で、がん細胞の増殖シグナルを抑える目的で使われます。)、Akt阻害薬(Aktというタンパク質の働きを止め、増殖シグナルを弱める薬です。)、mTOR阻害薬、ALDH(細胞内の有害な物質（アルデヒド）を分解したり、ビタミンA関連物質の代謝に関わったりする酵素で、がん幹細胞の目印として使われることがあります。)阻害薬、LDHA(乳酸を作る反応に関わる酵素の一部で、がんでは代謝を変えて増殖を助けることがあります。)阻害薬を単独または組み合わせて調べました。細胞死の指標としてカスパーゼ(細胞が自ら死ぬ仕組み（アポトーシス）で働く酵素で、活性が上がると細胞死が進んでいる目安になります。)活性も使いました。
マウス実験では、スフェロイド由来の細胞を移植して腫瘍を作り、薬を一定期間投与して腫瘍の大きさを追跡しました。さらに、ALDH1A1を増やす操作や、LDHAを減らす操作、mTORC1を活性化する薬の使用などで、仕組みを確かめました。

この研究は、患者由来スフェロイド(がん細胞を立体的に集めた球状の細胞のかたまりで、体内の腫瘍に近い環境を再現しやすいモデルです。)がPI3K–Akt–mTOR経路を狙う薬への反応の「個人差」を再現でき、試験管内の結果がマウス腫瘍の反応にもつながる可能性を示しました。つまり、治療薬の効きやすさを調べる実験モデルとして役立つかもしれません。
仕組みとしては、ALDH(細胞内の有害な物質（アルデヒド）を分解したり、ビタミンA関連物質の代謝に関わったりする酵素で、がん幹細胞の目印として使われることがあります。)活性が高い幹細胞様の細胞では、ALDHからLDHA(乳酸を作る反応に関わる酵素の一部で、がんでは代謝を変えて増殖を助けることがあります。)を通ってmTORC1(細胞が成長するためのタンパク質合成などを進める中心的な仕組みで、がんで過剰に働くと腫瘍が大きくなりやすくなります。)が活性化し、増殖が進むという流れ（ALDH–LDHA–mTORC1）が中心的に働く可能性が示されました。この流れは、PI3K/Aktの下流だけでは説明できない部分もあり、代謝と増殖シグナルが結びついている点が重要です。
治療の面では、ALDH阻害をPI3K阻害やAkt阻害と組み合わせると、単独より増殖を強く抑えられることが示されました。また、LDHAやmTORC1は、悪性度が高い子宮内膜がん(子宮の内側を覆う膜（子宮内膜）から発生するがんで、進行すると治療が難しくなる場合があります。)で狙える弱点になりうると考えられます。臨床的にもLDHA/LDH(血液検査でも測られる酵素で、体内で細胞が壊れたり腫瘍が活発だったりすると高くなることがあります。)が高いことは悪い経過と関係し、将来的なバイオマーカー(病気の状態や治療の効きやすさ、予後などを推測するために使える指標（血液検査の値や遺伝子発現など）です。)候補になりうることが示されました。

今後は、悪性度が高い子宮内膜がん(子宮の内側を覆う膜（子宮内膜）から発生するがんで、進行すると治療が難しくなる場合があります。)でALDH(細胞内の有害な物質（アルデヒド）を分解したり、ビタミンA関連物質の代謝に関わったりする酵素で、がん幹細胞の目印として使われることがあります。)–LDHA(乳酸を作る反応に関わる酵素の一部で、がんでは代謝を変えて増殖を助けることがあります。)–mTORC1(細胞が成長するためのタンパク質合成などを進める中心的な仕組みで、がんで過剰に働くと腫瘍が大きくなりやすくなります。)のつながりや、解糖系(ブドウ糖からエネルギーを作る基本的な代謝経路で、がん細胞はこれを強く使うことが多いです。)とmTORC1の「お互いを強め合う関係」をさらに詳しく調べ、治療戦略につなげる必要があります。
代謝の仕組みとmTORC1の相互作用を狙うことで、遺伝子変異の違いで反応が複雑になる場合でも、PI3K/Akt阻害を補う新しい治療の考え方が生まれる可能性があります。患者由来スフェロイド(がん細胞を立体的に集めた球状の細胞のかたまりで、体内の腫瘍に近い環境を再現しやすいモデルです。)を使って、変異プロファイルなどから薬の反応を予測できるかも、引き続き重要な課題です。さらに、LDHAや血清LDH(血液検査でも測られる酵素で、体内で細胞が壊れたり腫瘍が活発だったりすると高くなることがあります。)が本当に役立つ指標になるか、mTORC1の活性指標（phospho(タンパク質にリン酸が付いた状態を示し、スイッチが入って働いている目印として使われることが多いです。)-p70S6K(mTORC1が働いた結果として活性化しやすいタンパク質で、細胞の成長に必要なタンパク質合成を進めます。)など）との関係も含めて検証が求められます。