CRISPR/CasRxは新生児期マウスのKRAS変異誘発性脳動静脈奇形の形成を抑制する

脳動静脈奇形（brain arteriovenous malformations: bAVMs）は、本来介在するはずの毛細血管床を介さずに、動脈から静脈へ血液が直接流れる異常な血管のもつれであり、破裂や出血のリスクを高める。現在の治療（切除、塞栓術、放射線外科）は多くの場合有効だが、病変が大きい場合や機能的に重要な領域（eloquent regions）にある場合には高リスクになり得るため、非侵襲的アプローチへの関心が高まっている。bAVMsの多くは散発例であり、近年の研究により、散発例の相当数（報告範囲 28%–87%）で内皮細胞に体細胞KRAS変異が同定され、KRAS経路の恒常的活性化が原因である可能性が示唆されている。しかし、bAVMsの出生後発達（病変が出生後に新たに形成され、出血や発作が起こるまで無症状のまま経過し得るという点で重要）は、既存の動物モデルの限界（浸透率が低い、全身性のrecombination、技術的障壁、あるいは致死性）のため、研究が困難であった。本研究の目的は、(i) KRASにより誘導されるbAVM様病変が出生後早期の発達期に開始する、効率的で内皮特異的なマウスモデルを確立すること、(ii) RNAを標的とするCRISPR/CasRxアプローチにより変異KRASを抑制して病変形成を軽減できるかを検証すること、である。

出生後に内皮KRAS活性化を誘導する4つの戦略を試した結果、著者らは内皮特異性の高いモデルを同定した。すなわち、Cdh5-CreERT2;lsl-tdTomatoマウスに対し、P5でtamoxifenを投与しつつ、AAV-PHP.V1-CAG-DIO-HA-KRASG12Dをretro-orbital投与すると、神経細胞／グリアでの標識を最小限に抑えながら、tdTomato+の内皮病変が生じた。疾患の重症度はAAV用量で調整可能であった。ウイルス量を減らすと、マウスはより長く生存しつつ、出血性の脳病変と異常な血管のもつれを形成した。1 × 10^7 GCでは、病変数は脳あたり平均57.7 ± 13.0（n = 3）で、対照は0 ± 0（n = 3）であった。病変は注入後5日から15日にかけて複雑性が増し、一般に300–500 μmで、一部は1,000 μmを超え、血管径の拡大も示した。病変は広く分布したが小脳では発生が少なかった。出血は脊髄でも観察され、他臓器は概ね保たれていたが、脾臓の出血が時折みられた（5匹中4匹）。三次元解析（latex perfusionおよびCUBIC clearingとlight-sheet imaging）により、nidus様の構築が示された。すなわち、蛇行した血管のもつれが複数の流入動脈と拡張した流出静脈に連結し、動静脈シャントが直接存在し、動脈瘤様および静脈瘤様の接合部構造、さらにヒトbAVMsに似た多層性の血管配置が認められた。組織学的には、変異KRASを発現する内皮細胞でpERKの増加、Ki67陽性の散発、細胞および核サイズの増大がみられた。病変は微小出血に関連する所見（赤血球の血管外漏出、ヘモジデリンを含む貪食細胞）と炎症性浸潤（Iba1+ミクログリア／マクロファージ、反応性GFAP+アストロサイト、Ly6G+好中球、B220+ B細胞、ならびに散発的なCD3+ T細胞／MPO+好中球）を示した。scRNA-seq（総計16,747細胞；対照7,382；KRAS 9,365）では、毛細血管内皮クラスターが最も大きなトランスクリプトーム変化（上方制御116遺伝子、下方制御64遺伝子）を示し、KRAS活性化と内皮の恒常性／BBB関連遺伝子プログラムの破綻に整合する経路シグナルが示唆された。ヒトbAVM内皮のDEGsとの重なりは部分的で（共通の上方制御22、共通の下方制御87）、完全一致ではなかった。内皮以外でも、ミクログリア／マクロファージとアストロサイトで活性化関連の遺伝子発現変化、白血球集団の増加、ならびにKRAS条件で増殖性の線維芽細胞様perivascularクラスターの出現が報告された。治療面では、KRASG12D RNAを標的とするCRISPR/CasRxにより、in vitroでKRAS転写産物量が対照近くまで低下し、in vivoでも転帰が改善した。すなわち、CasRxとKRASG12D標的gRNAのAAV同時投与により、生存が延長し、強い誘導条件では出血／もつれの数と大きさが有意に減少した。また、低用量の「few nidus」モデルでは、P5で同時投与すると病変形成を完全に阻止し、病変が形成され始めた後（誘導14日後）に投与した場合でも病変サイズを縮小した。比較として、trametinibは病変減少に非有意な傾向を示すにとどまり、検討したレジメンでは成長と毛の異常を引き起こした。

本研究では、出生後早期にKRAS駆動の血管奇形を開始させる4つのアプローチを体系的に比較し、脳内皮細胞への発現制限に焦点を当てた。新生仔（P5）マウスに対し、低体温麻酔下でretro-orbitalからAAVを注射し、適用可能な場合はtamoxifenを併用してCreERを活性化した。アプローチは以下を含む：(1) Cdh5-CreERT2;lsl-KrasG12Dマウスでの遺伝学的誘導（P5でtamoxifen）では高い死亡率と最小限の血管表現型となった。(2) lsl-KrasG12Dlcl-EGFPマウスにAAV-PHP.V1-Ple261-iCreを注射すると、もつれが形成されたが、神経細胞／アストロサイトへのrecombination漏れがみられた。(3) AAV-PHP.V1-Ple261-iCreと、HA-KRASG12Dを発現するCre依存性AAVの共注射はP18までに致死で、オフターゲットのrecombinationも認めた。(4) 最終モデルとして、Cdh5-CreERT2;lsl-tdTomatoマウスにP5でtamoxifenを投与しつつAAV-PHP.V1-CAG-DIO-HA-KRASG12Dを注射し、高い内皮特異性を達成した。疾患重症度はAAVゲノムコピー数（6 × 10^10から1 × 10^7 GCまで）を変化させて調整し、主要解析には1 × 10^7 GCおよび3 × 10^7 GC条件が含まれた。病変負荷、サイズ、血管径は、ImageJを用いてtdTomato標識連続切片上で定量し、生存はlog-rank検定で評価した。nidus様シャント構造の検証には、実体顕微鏡観察、青色latex perfusion後のclearing、CUBIC tissue clearingとlight-sheet microscopy、ならびにIMARISによる3D再構成／トレースを用いた。病理および免疫組織化学では、MAPK活性化（pERK）、内皮増殖（Ki67）、変異タンパク局在（HA、RasG12D）、出血と鉄沈着（H&E、鉄染色）、グリア活性化（Iba1、GFAP）、免疫浸潤（Ly6G、B220、CD3、MPO）を評価した。トランスクリプトーム解析では、大脳皮質からtdTomato+およびtdTomato−細胞をFACSで分取（P13およびP20でサンプル採取）し、内皮を濃縮しつつ他細胞種も保持するためにプールして、10x Genomics single-cell 3′ v3.1で処理した。解析にはambient RNA除去（SoupX）、doubletフィルタリング（DoubletFinder）、Seuratによるクラスタリング／DEG検定（adjusted P < 0.05）、GO／経路解析（clusterProfiler、SCPA）を含めた。治療検証では、CasRx（RfxCas13d）とKRASG12D変異塩基をまたぐgRNAをAAVで投与し、KRAS誘導と同時（P5）または遅れて（P19）投与した。病変転帰はvehicleおよびtrametinib（1 mg/kg、2週間、毎日経口強制投与）と比較した。

本研究は、KRASG12Dにより駆動されるbAVM様疾患について、出生後に発症し内皮特異的なマウスモデルを提示した。このモデルは、動静脈シャントの直接存在、複数の流入動脈、拡張した流出静脈といったnidusを規定する特徴を備えた血管のもつれを再現性よく生じさせ、出血と炎症性／反応性の組織応答も伴った。AAV用量を調整することで、機序研究に有用な広範で急速に進行する病変も、成人まで生存し得てヒトに典型的な局所性の病変と長い無症状期により近い低病変負荷表現型も作り分けられる。組織学、血管の3D再構成、scRNA-seqに基づき、著者らは毛細血管内皮細胞が特に影響を受けやすいこと、病変形成には内皮MAPK活性化と内皮の形態学的肥大に加え、免疫細胞のリクルートやグリア活性化など、より広範な多細胞性応答が関与することを示した。重要なのは、変異KRAS配列を標的とするRNA標的型CRISPR/CasRx戦略が病変形成を大幅に抑制し、条件によっては検出可能な病変を完全に防ぎ得ること、さらに開始後に投与しても既存病変のサイズを低下させ得ることを示す概念実証を提供した点である。著者らは、試験条件下で効果が限定的で有害事象もみられた全身性MEK阻害に対し、より特異的かつ有効な代替となる可能性を位置づけている。

著者らは、モデルと治療戦略のさらなる発展・応用に向けた方向性をいくつか挙げている。第一に、病変は確率的な位置に発生し（ウイルス導入のばらつきを反映している可能性が高い）ため、奇形誘導をあらかじめ定めた脳領域に局在化する方法を確立できれば、より制御された研究が可能になる。これには、同一個体内で血管リモデリングと治療効果を追跡できる縦断的in vivo imaging（例：反復2-photon microscopyに適した皮質病変）も含まれる。著者らは、領域への直接AAV注入や循環ウイルスの磁気誘引を試したが成功しなかったと報告しており、別の標的化アプローチが必要である。第二に、変異KRASの過剰発現やウイルス感染そのものの影響によりヒト疾患と乖離する可能性、ならびに頭蓋外での出血所見（特に脾臓）の散発があるなど、現行システムの限界を指摘し、より特異的なAAVセロタイプや、より厳密な遺伝学的制限の開発が動機づけられるとしている。第三に、AAVの反復投与は抗AAV抗体を誘導して以降の導入効率を低下させ得るため、後期のAAV-CasRx投与による治療効果が過小評価されている可能性があり、反復治療設計のためには免疫学的障壁への対策が重要になる。最後に、著者らはこのプラットフォームを用いて、追加または併用の分子介入（KRAS経路構成要素を標的とする阻害薬を含む）を検証し、scRNA-seqに基づく仮説を用いて時間経過に伴う多細胞相互作用を解析することで、特に無症状期や手術高リスク状況におけるbAVMsに対し、より有効で低毒性の非侵襲的治療の同定を目指せると提案している。

脳動静脈奇形(脳の血管で、動脈と静脈が毛細血管をはさまずに直接つながってしまい、血管がもつれて出血しやすくなる病気です)は、本来なら動脈と静脈の間にある「毛細血管」を通らずに、動脈から静脈へ血液が直接流れてしまう血管の異常です。このため血管に強い負担がかかり、破裂して脳出血を起こす危険が高まります。
治療としては手術で切り取る方法、血管を詰める方法、放射線で治療する方法などがありますが、病変が大きい場合や脳の大事な場所にある場合は、治療そのものが危険になることがあります。そこで、体への負担が少ない治療法（非侵襲的な治療）への関心が高まっています。

最近、家族性ではない脳動静脈奇形（散発例(遺伝的に家族に同じ病気が多いタイプではなく、偶然起きることが多いタイプのことです)）の多くで、血管の内側を作る細胞（内皮細胞(血管の内側を一枚で覆っている細胞で、血管の形やバリア機能を保つのに重要です)）にKRASという遺伝子の変異が見つかり、この変異が病気の原因になっている可能性が示されました。一方で、この病気が「生まれた後に発達していく過程」を調べるための動物モデルは、これまでうまく作るのが難しいという問題がありました。

この研究の目的は、次の2つです。
1つ目は、出生後の早い時期に、内皮細胞だけでKRAS変異(KRASという遺伝子に起きた変化で、細胞増殖などのスイッチが過剰に入りやすくなり、病気の原因になることがあります)を働かせて病変ができる、効率のよいマウスモデルを作ることです。
2つ目は、RNAを狙うCRISPRの方法（CRISPR CasRx(DNAではなくRNAを狙って切るタイプのCRISPRで、特定のRNAを減らして遺伝子の働きを弱めるのに使えます)）で変異KRASを弱めることで、病変を減らせるかを確かめることです。

研究チームは、出生後に内皮細胞(血管の内側を一枚で覆っている細胞で、血管の形やバリア機能を保つのに重要です)でKRASを活性化させる方法を4種類試し、その中で「内皮細胞にかなり限定して」病変を作れる方法を見つけました。具体的には、生後5日目のマウスにtamoxifen(CreERT2のスイッチを入れるために使う薬で、投与すると狙った遺伝子操作が起こります)を使って仕組みをオンにし、AAV(遺伝子を細胞に運ぶためによく使われるウイルスベクターで、研究や遺伝子治療で利用されます)というウイルスベクターでKRASG12D(KRASの代表的な変異の一つで、特定の場所の変化によってKRASが働き続けやすくなります)を導入すると、神経細胞やグリア細胞への影響をできるだけ少なくしながら、内皮細胞由来の病変が作れました。さらに、AAVの量を調整することで病気の重さも調整できました。

AAV量を少なくすると、マウスはより長く生きられる一方で、出血を伴う脳の病変や血管のもつれが形成されました。ある条件では、病変数は脳あたり平均約58個で、対照群は0個でした。病変は注入後5日から15日の間にだんだん複雑になり、多くは0.3から0.5mmほどの大きさで、一部は1mmを超えました。血管が太くなる変化も見られました。病変は脳のいろいろな場所にできましたが、小脳では少なめでした。脊髄でも出血が見られ、他の臓器は基本的に保たれていましたが、脾臓で出血が起こることがありました。

三次元的な観察では、ヒトの脳動静脈奇形(脳の血管で、動脈と静脈が毛細血管をはさまずに直接つながってしまい、血管がもつれて出血しやすくなる病気です)に似た「nidus(脳動静脈奇形の中心部にある血管のもつれで、動脈と静脈が直接つながる重要な構造です)のような構造」が確認されました。つまり、曲がりくねった血管のもつれが、複数の流入動脈と、太くなった流出静脈につながり、動脈と静脈が直接つながる部分がありました。さらに、動脈瘤や静脈瘤のような形の接合部や、層が重なったような血管配置も見られました。

組織の観察では、KRAS変異(KRASという遺伝子に起きた変化で、細胞増殖などのスイッチが過剰に入りやすくなり、病気の原因になることがあります)を持つ内皮細胞でMAPK経路(細胞に増殖や変化の指令を伝える重要な信号の流れで、KRASの下流で働きます)が強く働いているサインが増え、細胞や核が大きくなる変化が見られました。また、赤血球が血管の外に漏れるような小さな出血の跡や、炎症に関わる細胞（ミクログリア(脳の中にいる免疫の細胞で、炎症や掃除の役割を持ちます)、マクロファージ(体の中で異物や壊れたものを処理する免疫細胞で、炎症反応に関わります)、好中球、B細胞など）が集まる反応も見られました。

遺伝子発現を細胞ごとに調べる解析では、特に毛細血管の内皮細胞が大きく変化しており、血液脳関門(血液中の物質が脳へ簡単に入りすぎないようにする仕組みで、脳を守るバリアとして重要です)に関わる性質が乱れている可能性が示されました。ヒトの病気で見られる変化と一部は共通していましたが、完全に同じではありませんでした。

治療の実験では、KRASG12DのRNAを狙うCRISPR CasRx(DNAではなくRNAを狙って切るタイプのCRISPRで、特定のRNAを減らして遺伝子の働きを弱めるのに使えます)を使うことで、培養細胞ではKRASの量が大きく減り、マウスでも生存が延び、出血や血管のもつれの数と大きさが減りました。病変が少ないモデルでは、早い時期に投与すると病変形成を完全に防げ、病変ができ始めた後に投与しても病変サイズを小さくできました。比較として使ったtrametinib(MAPK経路の一部であるMEKを抑える薬で、病変の進行を抑える可能性がある一方、副作用も問題になります)は、効果ははっきりせず、成長や毛の異常といった問題も起こしました。

この研究では、出生後の早い時期にKRAS変異(KRASという遺伝子に起きた変化で、細胞増殖などのスイッチが過剰に入りやすくなり、病気の原因になることがあります)による病変を起こす方法を4種類比べ、できるだけ脳の内皮細胞(血管の内側を一枚で覆っている細胞で、血管の形やバリア機能を保つのに重要です)に限って遺伝子が働く方法を探しました。生後5日目のマウスに、低体温麻酔を行った上で目の奥の静脈からAAV(遺伝子を細胞に運ぶためによく使われるウイルスベクターで、研究や遺伝子治療で利用されます)を注射し、必要に応じてtamoxifen(CreERT2のスイッチを入れるために使う薬で、投与すると狙った遺伝子操作が起こります)でCreERの仕組みを作動させました。

最終的に選ばれたモデルでは、Cdh5-CreERT2(薬剤でオンにできる遺伝子スイッチの仕組みで、特定の細胞だけで遺伝子を働かせるために使います)の仕組みを持つマウスにtamoxifenを投与しながら、KRASG12D(KRASの代表的な変異の一つで、特定の場所の変化によってKRASが働き続けやすくなります)をCre依存的に発現するAAVを投与しました。AAVの量を変えることで病変の数や重症度を調整し、組織切片の蛍光標識を使って病変数や血管の太さなどを測定しました。

血管の立体構造は、latexを流して血管を見やすくしたり、脳を透明化する方法と光シート顕微鏡を組み合わせたりして、三次元で再構成しました。さらに免疫染色などで、MAPK経路(細胞に増殖や変化の指令を伝える重要な信号の流れで、KRASの下流で働きます)の活性、内皮細胞の増殖、出血の跡、炎症反応などを評価しました。遺伝子発現の解析は、細胞を分けて単一細胞RNA解析を行い、どの細胞がどのように変化しているかを調べました。

CRISPR CasRx(DNAではなくRNAを狙って切るタイプのCRISPRで、特定のRNAを減らして遺伝子の働きを弱めるのに使えます)治療では、CasRxとKRASG12Dを狙うgRNA(CRISPRが狙う場所を案内する短いRNAで、どの配列を標的にするかを決めます)をAAVで投与し、KRAS導入と同時に投与する条件と、遅れて投与する条件の両方を調べました。薬剤治療としてtrametinib(MAPK経路の一部であるMEKを抑える薬で、病変の進行を抑える可能性がある一方、副作用も問題になります)も比較対象にしました。

この研究は、KRASG12D(KRASの代表的な変異の一つで、特定の場所の変化によってKRASが働き続けやすくなります)によって起こる脳動静脈奇形(脳の血管で、動脈と静脈が毛細血管をはさまずに直接つながってしまい、血管がもつれて出血しやすくなる病気です)に似た病変を、生まれた後に内皮細胞(血管の内側を一枚で覆っている細胞で、血管の形やバリア機能を保つのに重要です)で発症させられるマウスモデルを示しました。このモデルでは、動脈と静脈が直接つながる構造や、複数の流入動脈と拡張した流出静脈を含む血管のもつれなど、ヒトの病気に重要な特徴が再現され、出血や炎症反応も伴いました。

また、AAV(遺伝子を細胞に運ぶためによく使われるウイルスベクターで、研究や遺伝子治療で利用されます)の量を変えることで、病変が多数できて早く進行する状態から、病変が少なく長く生存できる状態まで作り分けられました。これにより、病気の仕組みを調べたり、治療法を試したりしやすくなります。

さらに重要なのは、変異KRASのRNAを狙うCRISPR CasRx(DNAではなくRNAを狙って切るタイプのCRISPRで、特定のRNAを減らして遺伝子の働きを弱めるのに使えます)が、病変の形成を大きく抑え、条件によっては病変を完全に防げること、病変ができ始めた後でもサイズを小さくできることを示した点です。全身に効く薬で副作用が出やすい方法よりも、より狙いを絞った治療の可能性を示しました。

今後の課題として、まず病変が脳のどこにできるかがランダムになりやすいので、決まった脳領域に病変を作る方法を確立できれば、より正確な研究ができると述べられています。例えば、同じ個体で時間を追って観察する画像解析も進めやすくなります。

次に、このモデルではKRAS変異(KRASという遺伝子に起きた変化で、細胞増殖などのスイッチが過剰に入りやすくなり、病気の原因になることがあります)の強い発現やウイルス感染そのものの影響で、ヒトの病気と少し違う可能性があり、また脾臓で出血が起きることもあるため、より狙いを絞れるAAV(遺伝子を細胞に運ぶためによく使われるウイルスベクターで、研究や遺伝子治療で利用されます)や遺伝学的な工夫が必要だとされています。

さらに、AAVを繰り返し投与すると免疫反応で効きにくくなる可能性があるため、将来の反復治療を考えるなら免疫の問題への対策が重要です。最後に、このモデルを使ってKRAS経路を狙う別の分子治療や組み合わせ治療を試し、無症状の時期も含めて病気の進行を抑える安全な治療法を探すことが提案されています。