ダサチニブとケルセチンは老化細胞除去剤として、代謝機能障害関連脂肪性肝疾患メダカモデルにおいて脂肪沈着の改善、抗線維化効果を示す

Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease（MASLD）は慢性肝疾患の原因として非常に頻度が高く、肝硬変、肝不全、肝細胞癌へと進行し得る。生活習慣や代謝リスクの管理にもかかわらず、著者らは、疾患を十分に制御できる有効な治療法は依然として不十分だと主張している。本論文は、MASLDの病態生理を細胞老化（cellular senescence）およびsenescence-associated secretory phenotype（SASP）と結び付け、SASPが炎症促進性および線維化促進性のメディエーターを介して肝の微小環境を作り替え、肝炎や線維化の進行に寄与し得るという観点から介入の動機を示している。こうした背景のもと、本研究は、senolytic薬であるdasatinibとquercetinにより老化細胞を除去することで、メダカ（Oryzias latipes）の高脂肪食（HFD）モデルにおけるMASLD関連の表現型が改善するかどうかを検証することを目的とした。著者らはまた、老化マーカー（p21、γH2AX、LMNB1）、組織学的な脂肪沈着と炎症、線維化および脂質関連遺伝子の発現、ならびに肝内マクロファージマーカー（CD68、Ym1）を調べることで、機序に関わるシグナルも探索した。

HFDメダカモデルでは老化関連シグナルが増加し、senolytic治療によってそれが軽減された。p21陽性細胞は対照群よりHFD群で多く（p < 0.0001）、治療群ではp21陽性細胞が減少して対照群と同程度の水準に戻った。γH2AXの免疫反応性も、治療により同様の低下を示した。老化生物学と整合的に、LMNB1発現は対照に比べHFDで低下し（p < 0.001）、治療群で対照様のレベルに回復した。個体および臓器レベルでは、HFD群で腹部膨満と、淡色で腫大し脂肪を多く含む肝臓がみられた一方、これらの肉眼的異常は治療で改善した。体重はHFDで増加し（対照0.41 ± 0.07 gに対し0.49 ± 0.05 g）、治療で低下した（0.40 ± 0.06 g；p < 0.001 vs HFD）。体重に対する肝重量比もHFDで増加し（0.016 ± 0.008に対し0.034 ± 0.010）、治療で改善した（0.019 ± 0.006；p < 0.01 vs HFD）。補足解析では、雌雄いずれでも同様の改善が示された。組織学的には、肝の脂肪沈着がHFD下で増加し（40.1% ± 13.2%）、治療後は低下した（18.4% ± 13.9%；p < 0.01 vs HFD）。また、HFD肝では顕著な炎症性浸潤がみられた。qPCR解析では、治療群における線維化促進シグナルの抑制が報告され、具体的にはTgfβ1の低下（通常食に対して0.47 ± 0.54-fold；p < 0.05）およびCol1a1の著明なダウンレギュレーション（HFDおよび通常食に対して0.26 ± 0.29-fold；p < 0.001）が示された。一方で、他のいくつかの線維化および脂質代謝関連転写産物は、統計学的有意差を伴わない傾向にとどまった。免疫組織化学はマクロファージの変化を示唆し、Ym1陽性（抗炎症／M2関連）細胞はHFDで減少し（対照30.5 ± 11.6に対し13.8 ± 9.5；p < 0.05）、治療で増加した（30.6 ± 17.9；p < 0.05）。一方、CD68陽性細胞は有意な変化を示さなかった。

d-rR/NAGOYA系統（ID: MT847）のメダカを、24 °C ± 2 °C、照明管理下で飼育し、2 L水槽あたり10匹とした。3群（対照食、HFD、HFD＋治療）を設定し、雌雄を含め各群13–20匹とした。先行するメダカ研究に基づきMASLD様の肝変化を誘導するため、6週間にわたり、対照飼料（Hikari Labo M-450）または高脂肪食（HFD32）を用い、20 mg/匹/日で給餌した。HFD給餌6週間後、曝露を均一にするため水槽水を介して7日間senolytic治療を行った。dasatinibは1.0 mg/L、quercetinは0.01 mg/Lとし、2日ごとに換水と再投与を行った。濃度は毒性・忍容性のパイロット（Supplementary Figure S1A）に基づき、さらに先行報告およびdasatinibのヒトC-maxの考慮も参照して選定した。評価項目は、肉眼所見、体重と体重に対する肝重量比、ならびにホルマリン固定パラフィン切片（10-µm）を用いた病理組織学的評価（ヘマトキシリン・エオシン染色）であり、脂肪沈着と炎症はImageJで定量した。免疫組織化学では、老化マーカー（p21、γH2AX）とLMNB1、ならびにマクロファージ関連マーカー（CD68、Ym1）を、指定の抗体およびDAB検出により測定した。肝の遺伝子発現は、RNA抽出、cDNA合成、定量PCR（SYBR Green；GAPDHを参照；2^−ΔΔCt）により解析し、線維化関連遺伝子（Col1a1、Mmp2、Timp2b、Tgfβ1）と脂質代謝遺伝子（Ppara、Pparγ）を対象とした。統計解析は一元配置ANOVAとTukeyの多重比較を用い、分散の等質性と分布の評価にBartlett検定およびKolmogorov–Smirnov検定を用いた。有意水準はp < 0.05とした。

著者らは、dasatinib–quercetin併用が、このメダカMASLDモデルにおいてsenolytic介入として作用すると結論づけている。根拠として、p21およびγH2AX陽性の減少と、LMNB1発現の回復を挙げる。これに伴う肝脂肪化の改善（組織学的脂肪面積の減少）、肝の肉眼所見の改善、体重に対する肝重量比の改善は、老化細胞除去後にMASLD様病態に対する治療的有益性が示唆されるものとして解釈されている。分子レベルでは、線維化関連遺伝子発現の調節、とりわけ治療魚におけるTgfβ1の抑制とCol1a1の低下を、抗線維化作用と整合的であるとして強調している。さらに、免疫調節の関与もあり得ると論じており、治療によりYm1陽性マクロファージが増加したことは抗炎症性のマクロファージ特性へのシフトを示唆する一方で、pan-macrophageであるCD68染色には有意差がなかったとしている。本研究の意義は、臨床で使用されるsenolyticsを、水槽水を介して均一に投与できる水生脊椎動物モデルで評価できる実現可能性と有用性を示した点、そして老化細胞を標的とすることがMASLDにおいて治療的に関連し得るというより広い概念を支持した点にあると位置づけられている。著者らは限界として、線維化評価が主に遺伝子発現レベルであり、モデルが進行した線維化として記述されていないこと、SASP因子（例：IL-6、IL1b）を直接評価していないこと、安全性と一般化可能性にはさらなる検証が必要であること、ならびに各薬剤単独と併用の機序的寄与を検証していないことを挙げている。

本論文は、今後の研究方向をいくつか示している。第一に、より進行した線維化モデルを用いていないことも踏まえ、IL-6やIL1bなどSASP関連メディエーターを評価し、老化細胞除去と炎症シグナルの関係をより明確にするとともに、直接効果か下流効果かを明らかにすることを提案している。第二に、単一のHFD駆動の肝脂肪化パラダイムにとどまらず他モデルで追加検証すること、ならびにこの文脈でのdasatinibとquercetinの安全性評価をより広範に行う必要性を強調している。第三に、相乗的なsenolytic作用という主張を裏づけるため、dasatinibとquercetinをそれぞれ単独投与する実験を提案し、老化細胞クリアランスの効果と、quercetinに提案されている脂質代謝への作用とを機序的に切り分けることを挙げている。第四に、肝脂質蓄積のより厳密な定量（Oil Red染色を含む）と脂肪代謝の経路レベルでのより深い検討、さらに（マクロファージ解析を含む）より広い免疫プロファイリングを推奨し、老化細胞ダイナミクスがMASLDにおける肝炎および線維化とどのように結び付くかを明らかにすることを求めている。

MASLDは、肝臓に脂肪がたまりやすくなる病気で、進行すると肝硬変や肝不全、肝臓がんにつながることがあります。食事や運動など生活習慣の改善が大切ですが、それだけでは病気を十分に抑えられる治療法がまだ足りないと考えられています。
この研究では、MASLDが「細胞老化(細胞が強いストレスや傷（DNAの損傷など）を受けて、分裂して増えるのをやめた状態です。老化した細胞自体が周りに悪影響を与えることがあり、病気の進行に関わるため注目されています。)」や「SASP」と関係している点に注目しました。老化した細胞が出す物質によって肝臓の環境が悪化し、炎症や線維化(肝臓の炎症や傷が続いた結果、硬い組織が増えて肝臓が固くなる変化です。進行すると肝硬変につながるため、治療で抑えるべき重要なポイントです。)が進む可能性があるため、老化細胞を取り除く治療が役立つかもしれません。
そこで、老化細胞を減らす薬であるdasatinib(もともとがんなどの治療に使われる薬で、老化細胞を死にやすくする働きが報告されています。老化細胞を減らす候補薬として使われています。)とquercetin(植物に含まれる成分で、抗酸化や抗炎症の性質が知られています。老化細胞の生き残りを助ける仕組みを弱めたり、SASPを抑える可能性があり、senolytic治療の組み合わせに使われます。)を使い、高脂肪食(脂肪の多い餌で、肝臓に脂肪がたまる状態を起こしやすくし、MASLDに似た変化を作るために用いられます。)を与えたメダカのMASLDモデルで、病気の状態が改善するかを調べました。あわせて、老化の目印となる指標、肝臓の脂肪のたまり具合、炎症、線維化に関わる遺伝子の変化、肝臓のマクロファージ(体の中で異物を処理したり炎症を調整したりする免疫細胞です。肝臓の炎症や回復、線維化にも関わるため、病気の状態を理解する上で重要です。)の状態も調べ、なぜ改善するのかも探りました。

高脂肪食(脂肪の多い餌で、肝臓に脂肪がたまる状態を起こしやすくし、MASLDに似た変化を作るために用いられます。)のメダカでは、老化に関係するサインが増えていましたが、dasatinib(もともとがんなどの治療に使われる薬で、老化細胞を死にやすくする働きが報告されています。老化細胞を減らす候補薬として使われています。)とquercetin(植物に含まれる成分で、抗酸化や抗炎症の性質が知られています。老化細胞の生き残りを助ける仕組みを弱めたり、SASPを抑える可能性があり、senolytic治療の組み合わせに使われます。)の治療でそれが弱まりました。老化の目印であるp21(細胞が分裂を止めるときに増えやすいタンパク質で、老化細胞の目印として使われます。老化細胞が増えているかを調べるのに役立ちます。)陽性の細胞は高脂肪食で増え、治療すると対照群に近いレベルまで減りました。γH2AX(DNAが傷ついたときに細胞内で増える目印で、老化と関係するDNA損傷の指標として使われます。老化やストレスの強さを知る手がかりになります。)も同じように治療で減りました。逆に、老化で減りやすいLMNB1(細胞核を支えるタンパク質の一つで、細胞老化が進むと減りやすいとされます。老化の状態を逆方向から確認する目印として使われます。)は高脂肪食で低下し、治療で回復しました。
見た目でも、高脂肪食のメダカはお腹がふくらみ、肝臓が白っぽく大きくなって脂肪が多い状態でしたが、治療で改善しました。体重や、体重に対する肝臓の重さの割合も、高脂肪食で悪化し、治療で改善しました。雌雄どちらでも同じ傾向でした。
顕微鏡で見ると、肝臓の脂肪のたまり具合は高脂肪食で増え、治療で減りました。また、高脂肪食の肝臓では炎症細胞の集まりが目立ちました。遺伝子の解析では、線維化(肝臓の炎症や傷が続いた結果、硬い組織が増えて肝臓が固くなる変化です。進行すると肝硬変につながるため、治療で抑えるべき重要なポイントです。)を進める方向のシグナルが治療で弱まることが示され、特にTgfβ1(線維化を進める働きが強いシグナルの一つです。これが増えると肝臓が硬くなる方向に進みやすく、治療効果の指標になります。)やCol1a1(線維化で増えやすいコラーゲンの材料になる遺伝子です。線維化が進んでいるか、抑えられているかを見る目安になります。)が下がりました。一方で、他の関連遺伝子はいくつか「変化しそう」という傾向はあっても、はっきりした差とは言えないものもありました。
免疫染色では、抗炎症に関係するYm1(抗炎症に関係するタイプのマクロファージで増えやすい目印として使われます。炎症を抑える方向に免疫が変化しているかを考える材料になります。)陽性細胞が高脂肪食で減り、治療で増えました。CD68(マクロファージ全体を広く示す目印として使われます。肝臓にどれくらいマクロファージがいるかを大まかに把握するのに使います。)陽性細胞は大きな変化がありませんでした。

d-rR/NAGOYA系統のメダカを、温度管理した水槽で飼育し、対照食群、高脂肪食(脂肪の多い餌で、肝臓に脂肪がたまる状態を起こしやすくし、MASLDに似た変化を作るために用いられます。)群、高脂肪食＋治療群の3群を作りました。6週間、高脂肪食でMASLDに似た肝臓の変化を起こさせた後、7日間、水槽水に薬を溶かして治療しました（dasatinib(もともとがんなどの治療に使われる薬で、老化細胞を死にやすくする働きが報告されています。老化細胞を減らす候補薬として使われています。)とquercetin(植物に含まれる成分で、抗酸化や抗炎症の性質が知られています。老化細胞の生き残りを助ける仕組みを弱めたり、SASPを抑える可能性があり、senolytic治療の組み合わせに使われます。)を併用し、2日ごとに水を替えて再投与）。
評価は、見た目の変化、体重と肝重量比、肝臓の切片を使った染色で脂肪沈着と炎症を定量する方法で行いました。さらに、免疫染色で老化マーカーやマクロファージ(体の中で異物を処理したり炎症を調整したりする免疫細胞です。肝臓の炎症や回復、線維化にも関わるため、病気の状態を理解する上で重要です。)マーカーを測定し、遺伝子発現は定量PCRで線維化(肝臓の炎症や傷が続いた結果、硬い組織が増えて肝臓が固くなる変化です。進行すると肝硬変につながるため、治療で抑えるべき重要なポイントです。)関連遺伝子と脂質代謝関連遺伝子を調べました。統計解析により、偶然ではない差かどうかを判断しました。

著者らは、dasatinib(もともとがんなどの治療に使われる薬で、老化細胞を死にやすくする働きが報告されています。老化細胞を減らす候補薬として使われています。)とquercetin(植物に含まれる成分で、抗酸化や抗炎症の性質が知られています。老化細胞の生き残りを助ける仕組みを弱めたり、SASPを抑える可能性があり、senolytic治療の組み合わせに使われます。)の併用は、このメダカのMASLDモデルで老化細胞を減らす治療として働いたと結論づけています。実際に、老化の目印であるp21(細胞が分裂を止めるときに増えやすいタンパク質で、老化細胞の目印として使われます。老化細胞が増えているかを調べるのに役立ちます。)やγH2AX(DNAが傷ついたときに細胞内で増える目印で、老化と関係するDNA損傷の指標として使われます。老化やストレスの強さを知る手がかりになります。)が減り、LMNB1(細胞核を支えるタンパク質の一つで、細胞老化が進むと減りやすいとされます。老化の状態を逆方向から確認する目印として使われます。)が回復しました。
その結果として、肝臓の脂肪のたまり具合が減り、肝臓の見た目や体重に対する肝重量比も改善しました。また、線維化(肝臓の炎症や傷が続いた結果、硬い組織が増えて肝臓が固くなる変化です。進行すると肝硬変につながるため、治療で抑えるべき重要なポイントです。)に関係する遺伝子（特にTgfβ1(線維化を進める働きが強いシグナルの一つです。これが増えると肝臓が硬くなる方向に進みやすく、治療効果の指標になります。)やCol1a1(線維化で増えやすいコラーゲンの材料になる遺伝子です。線維化が進んでいるか、抑えられているかを見る目安になります。)）の低下がみられ、線維化を抑える方向の変化が示されました。さらに、Ym1(抗炎症に関係するタイプのマクロファージで増えやすい目印として使われます。炎症を抑える方向に免疫が変化しているかを考える材料になります。)陽性細胞の増加から、肝臓の免疫環境が抗炎症側に傾く可能性も議論されています。
この研究の意義は、臨床で使われるsenolytic薬(老化した細胞を選んで減らすことを目指す薬のことです。老化細胞が病気を悪化させる場合に、原因の一部を取り除く考え方として研究されています。)を、水槽水を使って均一に投与できるメダカモデル(人の病気に似た状態を、メダカに食事などの条件を与えて再現し、病気の仕組みや治療効果を調べる方法です。薬を水槽水で投与しやすい点が利点です。)で評価できることを示し、老化細胞を標的にする治療がMASLDに役立つ可能性を支持した点にあります。
一方で、線維化の評価が主に遺伝子レベルであること、SASP因子を直接測っていないこと、安全性や他のモデルでも成り立つかは今後の確認が必要なこと、薬を単独で使った場合との違いを十分に分けて調べていないことが限界として挙げられています。

今後は、SASPに関係するIL-6やIL1bなどを測定し、老化細胞を減らすことが炎症シグナルにどう影響するのかを、よりはっきりさせることが提案されています。
また、高脂肪食(脂肪の多い餌で、肝臓に脂肪がたまる状態を起こしやすくし、MASLDに似た変化を作るために用いられます。)モデルだけでなく別のモデルでも結果を確かめ、dasatinib(もともとがんなどの治療に使われる薬で、老化細胞を死にやすくする働きが報告されています。老化細胞を減らす候補薬として使われています。)とquercetin(植物に含まれる成分で、抗酸化や抗炎症の性質が知られています。老化細胞の生き残りを助ける仕組みを弱めたり、SASPを抑える可能性があり、senolytic治療の組み合わせに使われます。)の安全性もより広く評価する必要があります。さらに、dasatinib単独、quercetin単独の実験を行い、併用による相乗効果や、それぞれの薬がどの仕組みで効いているのかを切り分けることも重要です。
加えて、脂肪のたまり具合をより正確に測る方法の導入や、脂質代謝の経路、免疫細胞の状態をより広く調べることで、老化細胞がMASLDの炎症や線維化(肝臓の炎症や傷が続いた結果、硬い組織が増えて肝臓が固くなる変化です。進行すると肝硬変につながるため、治療で抑えるべき重要なポイントです。)とどう結びつくのかを解明することが求められています。