酸性環境におかれた膀胱癌細胞はBcl-2とXIAPを介してシスプラチン耐性を獲得する

膀胱がん（bladder cancer: BC）は依然として罹患率と死亡率の主要因であり、免疫チェックポイント阻害薬、維持療法としてのavelumab、抗体薬物複合体（antibody–drug conjugates）といった近年の追加があるにもかかわらず、進行性尿路上皮がんの治療ではcisplatin（CDDP）ベースの化学療法が引き続き中心的な位置を占めている。しかし、プラチナ製剤レジメンの臨床的利益は、初期反応後にしばしば病勢進行が起きることで制限される。腫瘍微小環境（tumor microenvironment）は治療感受性を調節し得るため、微小環境の条件が治療不成功の説明として有力視されてきた。BCに関する先行研究では低酸素（hypoxia）が薬剤抵抗性に寄与すると強調されてきた一方で、細胞外の酸性化（extracellular acidification）の影響は比較的十分に検討されていない。そこで著者らは、酸性の微小環境が膀胱尿路上皮がん細胞のCDDP感受性を低下させるかどうか、低下させるのであればその表現型に関連する細胞内経路を、特にアポトーシスおよびオートファジー関連機構に焦点を当てて同定することを目的とした。本研究は、酸性条件とBCにおけるCDDP抵抗性増加の関連を報告する初めての研究であると述べている。

BC細胞株は、非腫瘍性のHEK293細胞よりも酸性培養条件に耐性を示し、酸ストレスへの適応性が高いことが示された。HT1376細胞では、中性条件下ではCDDPが増殖を抑制したが、酸性環境下では増殖への影響が小さく、低pHで薬剤感受性が低下することと整合した。定量的には、HT1376細胞におけるpH 6.0でのCDDPのIC50は4.268 μMであり、pH 7.5で観察された値のおよそ2倍であった。スクラッチアッセイでは、中性条件下ではCDDPが運動性（mobility）を低下させたが、酸性条件下では低下せず、酸性化がCDDP曝露中の遊走能（migratory capacity）も保護することが示唆された。機序面では、Western blot解析により、酸性条件でBcl-2およびXIAPの発現がより強く、またCDDP下でのアポトーシス実行（apoptotic execution）の活性化が弱いことを示すパターン（例：酸性条件ではcleaved caspase3の誘導が限定的）が認められた。オートファジー関連マーカーも変化し、LC3Bは中性pHで高値（CDDPによりわずかに増加）であった一方、p62/SQSTM1は酸性条件下で蓄積し、オートファゴソーム形成の低下および／またはオートファジーフラックスの変化と整合した。Beclin-1には明確なpH依存性の変化はみられなかった。総合すると著者らは、酸性条件が抗アポトーシス性シグナル（Bcl-2、XIAP）の協調と、オートファジー関連の細胞死の抑制を通じてCDDP抵抗性を促進すると解釈している。

本研究ではヒトBC細胞株のHT1376およびT24、ならびに非腫瘍性HEK293細胞を用いた。細胞は塩酸で調整した培地で培養し、pH 6.0からpH 7.5まで0.5刻みの条件を設定し、LAQAtwin pH monitorで確認した。薬剤応答は主に、CDDP曝露後0、24、48、72 hでのMTS細胞生存率アッセイにより評価し、IC50はGraphPad Prismで算出した。経路の関与を検討するため、著者らはchloroquineでオートファジーを、navitoclaxでBcl-2を薬理学的に標的化し、pH条件ごとにCDDPの有無で増殖への影響を評価した。細胞遊走は、pH 6.0とpH 7.5における24 hのスクラッチアッセイで、CDDPの有無も含めて測定し、ImageJで定量化した。細胞周期への影響は、CDDP処理24 h後にpropidium iodide/RNase染色とフローサイトメトリー（BD FACSCelesta™）で検討し、解析はFCS Expressで行った。アポトーシス関連の形態は、72 h処理後にヘマトキシリン染色で評価した。アポトーシスおよびオートファジーマーカー（Bcl-2、XIAP、cleaved PARP、LC3B、p62/SQSTM1、Beclin-1、HIF1αを含む）のタンパク質レベルの変化はWestern blottingで評価した。統計解析は一元または二元ANOVAと多重比較手法に基づき、有意水準はp < 0.05とした。

著者らは、酸性の微小環境は毒性を示し得る一方で、膀胱がん細胞においてcisplatin抵抗性を促進し得ること、またBC細胞は非腫瘍性細胞よりも酸耐性が高いことを結論づけている。HT1376細胞では、酸性化によりCDDPによる増殖抑制が弱まり、中性条件下で観察されたCDDP関連の遊走能低下も防がれた。分子レベルでは、酸性条件が抗アポトーシス性メディエーター（Bcl-2とXIAP）を上方制御し、オートファジー活性の低下（p62/SQSTM1の蓄積を伴うLC3B低下）と関連することで、CDDP治療中のアポトーシスおよびオートファジー関連の細胞死を総合的に弱めると著者らは主張している。また、HIF1αはpH単独では明確に変化しなかったが、酸性条件下ではCDDPにより軽度に増加したため、この状況での役割は未解明であるとも述べている。本研究は、微小環境の酸性化がBCにおける治療反応性を低下させ、ひいては予後を悪化させ得ることを示す証拠として位置づけられており、細胞外pHがプラチナ製剤の有効性を左右する臨床的に重要な決定因子である可能性を強調している。

論文では、細胞外の酸性がCDDP抵抗性に寄与するのであれば、局所の細胞外環境を正常化する戦略が治療反応の改善につながり得ると論じている。著者らは、腫瘍アシドーシス（tumor acidosis）の是正（例：経口クエン酸塩製剤）が腫瘍周囲pHを上昇させ治療成績を改善したという先行の動物研究を挙げ、さらに、経口のsodium bicarbonateによる尿のアルカリ化が、表在性膀胱がんに対する膀胱内mitomycin Cの有効性を高め得るという臨床的エビデンスを引用している。本研究の実験文脈においては、薬剤分布の変化以外の抵抗性機序について追加検討が必要であることを強調し、CDDPの作用には酸化ストレスが関与し、酸性環境がこの生物学に影響し得る点を指摘している。さらに、酸素条件が変わらない状況でのHIF1αの役割や、Bcl-2に連なる抗アポトーシス性シグナルと、酸性pH下でのオートファジーマーカー抑制との正確な関係など、未解決の機序的課題も示している。総じて著者らは、治療的アルカリ化、またはBcl-2/XIAP関連経路の標的化が、BCにおける酸性条件に関連した薬剤抵抗性を逆転できるかどうかを今後検証すべきだと提案している。

膀胱がん(膀胱にできるがんで、進行すると治療が難しくなりやすい病気です。)は、今でもかかる人や亡くなる人が多いがんの一つです。免疫を利用した薬（免疫チェックポイント阻害薬(がんが免疫から逃げる仕組みをブロックして、免疫ががんを攻撃しやすくする薬です。)）や、治療後に効果を保つための薬（avelumab(免疫チェックポイント阻害薬の一つで、化学療法後に病気が悪化していない患者で効果を維持する目的でも使われます。)による維持療法）、抗体薬物複合体(がん細胞を見つけやすい抗体に、細胞を殺す薬を結びつけた治療薬で、狙った細胞に薬を届ける考え方です。)など新しい治療も増えてきましたが、進行した尿路上皮がん(膀胱や尿管などの内側をおおう「尿路上皮」から発生するがんで、膀胱がんの多くがこれに当たります。)では、今もcisplatin(がん細胞のDNAを傷つけて増殖を止め、細胞死を起こしやすくする抗がん剤で、膀胱がん治療の基本薬の一つです。)を使う化学療法が中心です。
ただし、cisplatinなどのプラチナ系の治療は、最初は効いても、その後にがんが再び進んでしまうことが多いという問題があります。

そこで注目されているのが、がん細胞の周りの環境（腫瘍微小環境(がん細胞の周りの環境（酸素量、pH、免疫細胞、血管など）で、治療の効きやすさやがんの性質に影響します。)）です。これまで膀胱がんでは「低酸素(酸素が少ない状態で、がんが薬に強くなったり悪性化したりする要因の一つとして研究されています。)（酸素が少ない状態）」が薬の効きにくさに関係すると言われてきましたが、「周りが酸性になること（細胞外の酸性化(細胞の外側の環境が酸性に傾くことです。腫瘍では代謝の影響で起こりやすく、薬の効き方に関係する可能性があります。)）」の影響はあまり調べられていませんでした。
この研究は、がんの周りが酸性になると、膀胱尿路上皮がん細胞がcisplatinに効きにくくなるのかを調べ、もし効きにくくなるなら、その理由として細胞内の仕組み（特にアポトーシス(細胞が自分で決められた手順に従って死ぬ仕組みで、がん治療ではこの仕組みを起こさせることが重要です。)とオートファジー(細胞内の不要なものを分解して再利用する仕組みで、状況によっては細胞を守ることも、細胞死に関わることもあります。)）にどんな変化が起きるのかを明らかにすることを目的としています。

膀胱がん(膀胱にできるがんで、進行すると治療が難しくなりやすい病気です。)の細胞は、がんではないHEK293細胞よりも、酸性の環境でも生き残りやすいことがわかりました。
HT1376という膀胱がん細胞では、中性に近い環境ではcisplatin(がん細胞のDNAを傷つけて増殖を止め、細胞死を起こしやすくする抗がん剤で、膀胱がん治療の基本薬の一つです。)が細胞の増殖を抑えましたが、酸性の環境では増殖があまり抑えられず、酸性だと薬が効きにくいことが示されました。実際に、cisplatinの効きにくさを表すIC50(薬の効き具合を数値化した指標で、「増殖や生存を半分にするのに必要な濃度」です。値が高いほど薬が効きにくいと考えます。)は、pH(酸性かアルカリ性かを示す尺度で、数字が小さいほど酸性が強いです。) 6.0ではpH 7.5の約2倍でした。

また、細胞の動きやすさを見る実験では、中性の環境ではcisplatinによって細胞の動きが弱まりましたが、酸性の環境ではその弱まりが見られませんでした。つまり酸性環境は、薬を当てている間でもがん細胞の移動（広がりやすさ）を保つ可能性があります。

仕組みの面では、酸性環境だとBcl-2(細胞がアポトーシスを起こすのを抑えるタンパク質で、増えるとがん細胞が死ににくくなります。)やXIAP(アポトーシスに必要な酵素の働きを止めて、細胞死を抑えるタンパク質です。多いと治療が効きにくくなることがあります。)が多くなり、細胞が死ぬ仕組み（アポトーシス(細胞が自分で決められた手順に従って死ぬ仕組みで、がん治療ではこの仕組みを起こさせることが重要です。)）が起こりにくい方向の変化が見られました。さらに、オートファジー(細胞内の不要なものを分解して再利用する仕組みで、状況によっては細胞を守ることも、細胞死に関わることもあります。)に関係する指標も変化し、酸性環境ではp62/SQSTM1(分解したいタンパク質などをオートファゴソームへ運ぶ役割があり、たまりやすいとオートファジーの流れが弱い可能性があります。)がたまりやすく、オートファジーの流れが弱まっている可能性が示されました。全体として、酸性環境は「細胞を死ににくくする仕組み」を強めて、cisplatin抵抗性を高めると考えられます。

ヒトの膀胱がん(膀胱にできるがんで、進行すると治療が難しくなりやすい病気です。)細胞（HT1376、T24）と、がんではない細胞（HEK293）を使いました。培地のpH(酸性かアルカリ性かを示す尺度で、数字が小さいほど酸性が強いです。)を塩酸で調整し、pH 6.0〜7.5まで0.5刻みで条件を作って実験しました。
cisplatin(がん細胞のDNAを傷つけて増殖を止め、細胞死を起こしやすくする抗がん剤で、膀胱がん治療の基本薬の一つです。)を加えた後の細胞の生き残りはMTSアッセイ(細胞が生きているか（代謝が働いているか）を色の変化で測る方法で、薬の効き具合の評価に使います。)で時間ごとに測り、IC50(薬の効き具合を数値化した指標で、「増殖や生存を半分にするのに必要な濃度」です。値が高いほど薬が効きにくいと考えます。)を計算しました。

さらに、オートファジー(細胞内の不要なものを分解して再利用する仕組みで、状況によっては細胞を守ることも、細胞死に関わることもあります。)に関わる仕組みを確かめるためにchloroquine(本来は感染症治療などで使われる薬で、研究ではオートファジーを止める目的で使われます。)を使い、Bcl-2(細胞がアポトーシスを起こすのを抑えるタンパク質で、増えるとがん細胞が死ににくくなります。)に関わる仕組みを確かめるためにnavitoclax(Bcl-2の働きを弱めて細胞死を起こしやすくする薬で、がん細胞の生存機構を調べるのに使われます。)を使って、pH条件ごとに増殖への影響を調べました。細胞の移動はスクラッチアッセイ(細胞を一面に増やして人工的に傷（すき間）を作り、どれくらい埋まるかで細胞の移動のしやすさを調べる方法です。)で測定し、細胞周期(細胞が増えるために進む段階の流れで、抗がん剤はこの流れを止めることで効くことがあります。)はフローサイトメトリー(細胞を1個ずつ測定して性質を調べる装置・方法で、細胞周期の解析などに用いられます。)で確認しました。タンパク質の変化はWestern blot(特定のタンパク質がどれくらいあるかを調べる実験方法で、細胞内の変化を確認するのに使います。)で調べ、統計的な差はANOVAで評価しました。

酸性の環境は細胞にとって負担にもなりますが、膀胱がん(膀胱にできるがんで、進行すると治療が難しくなりやすい病気です。)細胞では逆にcisplatin(がん細胞のDNAを傷つけて増殖を止め、細胞死を起こしやすくする抗がん剤で、膀胱がん治療の基本薬の一つです。)が効きにくくなる方向にも働くことが示されました。膀胱がん細胞は、がんではない細胞より酸性に強いことも確認されました。
また、酸性環境ではBcl-2(細胞がアポトーシスを起こすのを抑えるタンパク質で、増えるとがん細胞が死ににくくなります。)やXIAP(アポトーシスに必要な酵素の働きを止めて、細胞死を抑えるタンパク質です。多いと治療が効きにくくなることがあります。)が増え、アポトーシス(細胞が自分で決められた手順に従って死ぬ仕組みで、がん治療ではこの仕組みを起こさせることが重要です。)が起こりにくくなること、そしてオートファジー(細胞内の不要なものを分解して再利用する仕組みで、状況によっては細胞を守ることも、細胞死に関わることもあります。)に関わる変化も起きて細胞死が弱まる可能性が示されました。つまり、がんの周りのpH(酸性かアルカリ性かを示す尺度で、数字が小さいほど酸性が強いです。)（酸性かどうか）が、cisplatin治療の効きやすさを左右する重要な要因になり得る、という点に意味があります。

もし酸性環境がcisplatin(がん細胞のDNAを傷つけて増殖を止め、細胞死を起こしやすくする抗がん剤で、膀胱がん治療の基本薬の一つです。)抵抗性を高めるなら、がんの周りを「酸性から中性寄りに戻す」工夫が治療効果を上げるかもしれません。論文では、腫瘍周囲の酸性を弱める方法として、クエン酸塩製剤でpH(酸性かアルカリ性かを示す尺度で、数字が小さいほど酸性が強いです。)を上げて治療成績が良くなった動物研究や、sodium bicarbonateで尿をアルカリ性にして膀胱内治療（mitomycin C(膀胱内に薬を入れる治療などで使われる抗がん剤で、尿のpHが効果に影響する可能性が報告されています。)）の効果が上がったという報告が紹介されています。
また、酸性環境では薬の届き方が変わる可能性だけでなく、酸化ストレス(活性酸素などによって細胞がダメージを受ける状態で、cisplatinの作用にも関係するとされています。)など別の仕組みも関係しているかもしれないため、さらに調べる必要があるとしています。将来的には、治療的にアルカリ化(酸性を弱めてpHを上げることです。尿や腫瘍周囲の環境を変える治療の考え方として出てきます。)する方法や、Bcl-2(細胞がアポトーシスを起こすのを抑えるタンパク質で、増えるとがん細胞が死ににくくなります。)やXIAP(アポトーシスに必要な酵素の働きを止めて、細胞死を抑えるタンパク質です。多いと治療が効きにくくなることがあります。)に関わる経路を狙う方法で、酸性環境による薬剤抵抗性(薬を使っても効きにくくなる性質で、治療が続くと起きることがあります。)を弱められるかが課題になります。