Increase in Indole -3- acetic Acid (IAA) level and Nitrilase Activity in Turnips Induced by Plasmodiophora brassicae Infection

アブラナ科作物の主要病害である根こぶ病（clubroot）は、絶対寄生性の根部病原体 *Plasmodiophora brassicae* によって引き起こされる。しかし、この病原体は人工培地で培養できず、胞子形成（sporulation）の制御も難しいため、生化学的な基盤は不明な点が多い。先行研究では、肥大した組織で植物ホルモン（インドール-3-酢酸（indole-3-acetic acid, IAA）を含む）の増加が報告されていたが、IAAが長期の発育時間軸で追跡されていなかったことなどから、証拠は十分に確立していないと考えられていた。著者らは、根こぶ病抵抗性のカブ（turnip）カルスで、休眠胞子（resting spores）との接触によりphenylalanine ammonia lyase（PAL）が誘導されうること、またPAL関連代謝がIAA生合成と結びつきうるという示唆を踏まえ、感染のどの時期にIAAが変化するのかを明確にすることを目的とした。具体的には、播種後20〜90日の期間にわたり、感染根と健全根のIAAを定量した。さらに、IAA増加がde novo合成を反映する可能性を検討するため、トリプトファン由来のIAA経路における中間酵素であるnitrilase活性を測定した。

病害の進行に伴い、根の成長パターンは分岐した。播種後20〜40日では感染個体と健全個体の根重は同程度だったが、40〜55日では健全根が急増した一方、感染根の増加は中程度にとどまった。肉眼的な根こぶ病症状は約30日後から現れ、45日後には明瞭となった。健全根のIAA濃度は初期に変動したのち安定し、20日で1.7 nmol per g fresh weight（FW）、30日で0.8に低下し、35日で1.5に上昇した後、45日までに約0.5へ低下し、90日までほぼその水準を維持した。感染根でも初期の変動は同様だったが、20〜35日の期間は一貫して健全根より約0.5 nmol per g FW高かった。症状が明確になる時期には後期の顕著な上昇が観察され、40日および45日には感染根のIAAが健全根の最大5倍まで上昇し、45日で最大となった。この最大値は、健全根の20日における水準と同程度であった。45日以降、感染根のIAAは徐々に低下し、90日には健全根と同水準に戻った。nitrilase活性も感染に関連した顕著なピークを示した。健全根では20日の0.01 nmol per gから35日の0.3へ上昇した後、その後は約0.1へ低下した。一方、感染根では25日以降に急増し、45日に0.8 nmol per gでピークに達したのち、55日までに健全レベルへ低下した。著者らは、nitrilase活性がIAAの変動パターン全体を完全には反映しないとしつつも、45日にnitrilase活性とIAAがともに最大となった一致は、感染後期におけるnitrilaseに結びついた生合成経路の関与を支持すると述べている。

本研究では、カブ（turnip；*Brassica campestris* L. subsp. *Rapa* cv. Natsumaki 13-go Kokabu）を滅菌土壌で、管理条件下（25 ℃、暗期/明期12 h、10,000 Lux）にて栽培した。感染は播種後7〜8日に、*P. brassicae* の休眠胞子を含む土壌約10 g（乾土1 gあたり10^9 spores）を各苗に添加して開始し、対照区には汚染土壌を加えなかった。病徴の出現観察および葉を除去した後の根重測定により、病害進行と成長への影響を追跡した。IAA定量では、播種後20〜90日の定めた時点で根1 gの試料を採取し、0.01% ascorbic acidを含む100% methanolで2回抽出、濃縮後、Dowex 50W（H+ form）およびDEAE ToyoPearl 650Mによるクロマトグラフィーで順次精製した。最終抽出物は、TSK-Gel ODS-80TSカラムを用いたHPLCで、40% methanol＋1% acetic acid条件下、蛍光検出（励起280 nm、蛍光350 nm）により解析し、IAA標準品と比較して定量した。nitrilase活性は、根タンパク質抽出液（超遠心により清澄上清を得る工程を含む）を用い、1 mM indole-acetonitrileと37 ℃でインキュベートした後、IN HClとethyl acetateで反応を停止し、生成物を回収した。さらにIAA定量と同一のカラム精製工程でクリーンアップし、生成したIAAをHPLCで定量した。緩衝液のみの反応を対照とした。

播種後20〜90日の発育期間全体を通じて、IAAは感染直後に単純に増加するのではなく、最も顕著な増加は後期に生じ、根こぶ病症状が最大となる播種後約45日にピークを示した。これに基づき著者らは、「一次感染に直接応答してIAAが増加する」という一般的に想定されてきた時期設定は、カブ根の経時データからは支持されないと論じている。後期のIAAスパイクにはnitrilase活性の強い上昇が伴い（感染根の45日で0.8 nmol per g、同齢の健全根では約0.1 nmol per g）、著者らはこれを、感染後期におけるnitrilaseが関与するトリプトファン由来経路からのIAA生合成増強と整合的だと解釈した。nitrilase活性のみでは観察されたIAA動態のすべてを説明できないことを認めつつも、後期のIAA上昇はIAA分解の低下よりもde novo合成に起因する可能性が高いと結論づけた。長期にわたるIAA定量と酵素活性測定を組み合わせることで、本研究は感受性宿主における根こぶ病進展中の、ホルモン関連代謝変化を時間分解能をもって示した。

著者らは、さらなる検討を要する未解決課題を複数挙げている。第一に、IAA増加の説明としてIAA分解の低下と合成増加を代替仮説として考える一方で、感染後期に高いIAAレベルがなぜ・どのように達成されるのかは未解明であり、より深い機構研究が必要だとしている。第二に、IAAとnitrilaseの変化を、宿主組織内における病原体の発育段階と関連づける必要性を強調し、nitrilase誘導はsporulating plasmodiaに依存する可能性を示す証拠があることから、感染根における *P. brassicae* の各ステージの寿命と進行を決定することが、IAA変動の説明にとって特に重要だと述べている。第三に、nitrilase活性は初期段階のIAA変化と一致しなかったため、初期のIAAは別の生合成経路による、あるいは地上部組織からの輸送による可能性があるとして、発育段階ごとの経路識別が必要だと提案している。最後に、IAA合成に関与すると示唆されている別要因としてperoxidaseにも言及し、防御応答との関係を論じたうえで、防御関連酵素（抵抗性と感受性のカルスで以前に研究されたものを含む）、peroxidase、そして感受性カブにおける後期IAA蓄積の間のつながりは、今後明確化されるべきだと結んでいる。

アブラナ科の作物で大きな被害を出す根こぶ病(アブラナ科植物の根がこぶのようにふくらみ、生育が悪くなる病気です。根がうまく働かなくなり、水や栄養の吸収が落ちて収量が下がるため重要です。)は、根に寄生する病原体のPlasmodiophora brassicae(根こぶ病を起こす病原体で、植物の根に寄生して増えます。実験室の人工培地で増やしにくく、研究が難しい原因の一つです。)によって起こります。ところが、この病原体は実験室の人工的な培地では増やせず、胞子を作る過程も思い通りにコントロールしにくいため、病気が進む仕組みには分からない点が多く残っていました。
これまで、病気でふくらんだ根の組織では植物ホルモン(植物の体の中で少量でも働き、成長や発達、環境への反応を調整する物質です。病気によってバランスが変わることがあります。)のIAA(植物ホルモンの一つで、正式にはインドール酢酸と呼ばれます。細胞の伸びや根の形づくりに関わり、量が変わると根の成長や病気の症状にも影響します。)が増えると言われてきましたが、植物の成長期間全体を通してIAAがどう変わるかは十分に調べられておらず、はっきりした証拠とは言い切れない状況でした。
そこでこの研究では、カブの根が感染してから時間がたつにつれて、IAAがいつ増えるのかをはっきりさせることを目的にしました。具体的に、播種後20日から90日まで、感染した根と感染していない根のIAA量を測りました。さらに、IAAがその場で新しく作られて増えた可能性を調べるため、IAA合成に関わる酵素であるnitrilase(ある物質からIAAを作る途中で働く酵素です。活性が上がるとIAAが新しく作られている可能性を示す手がかりになります。)のはたらきも測定しました。

病気の進行にともない、根の成長のしかたに違いが出ました。播種後20〜40日では感染株と健全株の根の重さはほぼ同じでしたが、40〜55日では健全株の根が急に重くなった一方、感染株は増え方が小さめでした。根こぶ病(アブラナ科植物の根がこぶのようにふくらみ、生育が悪くなる病気です。根がうまく働かなくなり、水や栄養の吸収が落ちて収量が下がるため重要です。)の見た目の症状は約30日後から出始め、45日後にははっきりしました。
健全な根のIAA(植物ホルモンの一つで、正式にはインドール酢酸と呼ばれます。細胞の伸びや根の形づくりに関わり、量が変わると根の成長や病気の症状にも影響します。)濃度は、20日で1.7、30日で0.8に下がり、35日で1.5に上がった後、45日までに約0.5へ下がり、90日までほぼそのままの低い水準で推移しました。
感染した根でも20〜35日は同じように増減しましたが、この期間はずっと健全根より約0.5高い値でした。さらに症状がはっきりする40日と45日には、感染根のIAAが急に増え、健全根の最大5倍まで上がり、45日で最大になりました。その後はIAAが少しずつ下がり、90日には健全根と同じくらいに戻りました。
nitrilase(ある物質からIAAを作る途中で働く酵素です。活性が上がるとIAAが新しく作られている可能性を示す手がかりになります。)活性も感染と関係して大きく変化しました。健全根では20日にとても低く、35日にいったん高くなった後は下がりました。一方、感染根では25日以降に急に上がり、45日に最も高くなってから、55日までに健全レベルに戻りました。IAAの増減すべてをnitrilaseだけで説明できるわけではないものの、45日にIAAとnitrilase活性がどちらも最大になった点は、感染後期にIAAが新しく作られて増えた可能性を支える結果だと考えられました。

カブを滅菌した土で育て、温度や明るさを管理した環境で栽培しました。播種後7〜8日に、病原体の休眠胞子(環境が悪いときでも長く生き残れる、活動を止めた状態の胞子です。土の中で残り続け、次の感染源になるので防除が難しくなります。)を含む土を苗に加えて感染させ、対照として感染させない株も用意しました。病気の症状がいつ出るかを観察し、葉を取り除いた根の重さを測って成長への影響を調べました。
IAA(植物ホルモンの一つで、正式にはインドール酢酸と呼ばれます。細胞の伸びや根の形づくりに関わり、量が変わると根の成長や病気の症状にも影響します。)は、決めた日に根を採取して抽出し、クロマトグラフィー(混ざった物質を性質の違いで分けて取り出す方法です。IAAを正確に測るために、不純物を減らす目的で使います。)で精製した後、HPLC(液体を使って物質を分離し、量を測る分析装置です。IAAのような少量の成分を比較的正確に測定できるため重要です。)という装置で測定しました。nitrilase(ある物質からIAAを作る途中で働く酵素です。活性が上がるとIAAが新しく作られている可能性を示す手がかりになります。)活性は、根から取り出したタンパク質を使い、基質を加えて反応させ、できたIAA量を同じくHPLCで測って評価しました。

IAA(植物ホルモンの一つで、正式にはインドール酢酸と呼ばれます。細胞の伸びや根の形づくりに関わり、量が変わると根の成長や病気の症状にも影響します。)は、感染した直後に単純に増えるのではなく、病気の症状が最も強くなる播種後約45日ごろに大きく増えることが分かりました。つまり、「一次感染(感染の最初の段階で、病原体が植物に入り始める時期を指します。IAAがいつ増えるかを考える際の基準になる概念です。)にすぐ反応してIAAが増える」とよく想定されてきた考え方は、少なくともカブの根を時間を追って調べた結果からは支持されにくいと示されました。
また、45日ごろのIAAの大きな増加にはnitrilase(ある物質からIAAを作る途中で働く酵素です。活性が上がるとIAAが新しく作られている可能性を示す手がかりになります。)活性の強い上昇が伴っていたため、感染後期にはトリプトファン(アミノ酸の一種で、植物の中でIAAを作る材料の一つになります。IAA増加の仕組みを考えるときの出発点になります。)由来の経路でIAAが新しく作られやすくなっている可能性が高いと考えられました。nitrilase活性だけではIAAの動きをすべて説明できない点は残るものの、後期のIAA増加は分解が弱まったというより、新しく合成された影響が大きいと結論づけました。長期間のIAA測定と酵素活性(酵素がどれくらい強く働いているかを表す指標です。合成経路がどの程度動いているかを推測するために使います。)測定を組み合わせたことで、病気の進行中に起きるホルモン関連の変化を時間の流れに沿って示した点に意義があります。

今後の課題として、まず感染後期にIAA(植物ホルモンの一つで、正式にはインドール酢酸と呼ばれます。細胞の伸びや根の形づくりに関わり、量が変わると根の成長や病気の症状にも影響します。)が高くなる理由や仕組みを、より詳しく調べる必要があるとしています。また、IAAやnitrilase(ある物質からIAAを作る途中で働く酵素です。活性が上がるとIAAが新しく作られている可能性を示す手がかりになります。)の変化を、根の中で病原体がどの段階にいるのかと結びつけて理解することが重要だと述べています。特に、胞子を作る段階の病原体がnitrilaseの増加に関係している可能性があるため、感染組織内での病原体の各段階がどれくらい続くのかを明らかにする必要があります。
さらに、初期のIAA変化はnitrilase活性の変化と一致しなかったため、初期には別の合成経路が働いているか、地上部からIAAが運ばれてきている可能性も考えられます。加えて、IAA合成や防御反応と関係があるとされるperoxidase(過酸化水素などに関わる反応を進める酵素の一群です。防御反応との関係が深いとされ、IAAの合成や分解に関わる可能性も議論されています。)など他の要因も含めて、どの酵素や反応が後期のIAA蓄積につながるのかを整理していくことが求められます。