根分法によるダイズ根粒超着生変異株の茎葉部から地下部への窒素の再循環

ダイズ（*Glycine max* (L.) Merr.）は、タンパク質に富む種子を形成するために多量の窒素（N）投入を必要とする。ダイズは、根粒菌（rhizobia）と形成する根粒での共生的なN2固定によりNを獲得できる一方、畑地では一般に硝酸塩として土壌中のNも吸収する。古くからの問題として、硝酸塩は根粒形成、根粒の成長、および窒素固定活性を強く阻害することが知られており、この阻害は、分割根（split-root）研究で観察される局所的効果と全身的効果の双方を通じて生じる。これまでに多くの機構（例：光合成産物の供給低下、O2拡散の変化、あるいはN代謝物を介した地上部由来のフィードバック）が提案されてきたが、決定的な説明は得られていない。過剰根粒形成（hypernodulation）変異系統（例：NOD1-3、NOD2-4、NOD3-7）は、野生型品種よりもはるかに多くの根粒を形成し、硝酸塩に対する部分的な耐性も示すため、候補機構を検証するための有用な遺伝学的システムとなる。本論文は、15N標識硝酸塩を用いた分割根実験により、地上部から地下部器官へ戻る「硝酸塩由来Nの再循環」が、過剰根粒形成変異体と野生型親系統Williamsで異なるかどうかを評価することを目的とした。

系統間で総乾物重に有意差はなかったが、過剰根粒形成変異体は、基部根粒（basal nodules）の根粒乾物重がWilliamsより大きかった（例：Williams 0.168 gに対しNOD1-3 0.483 g）。割合でみると、根粒乾物重の分配はWilliams（4.0%）に比べて変異体で2倍以上（8.5–10.9%）であった一方、根の乾物重分配は変異体（約20.9–22.3%）の方がWilliams（32.2%）より低かった。窒素濃度は、過剰根粒形成系統のいくつかの器官（葉、茎、基部根、基部根粒）でWilliamsより高い傾向があり、植物体全体のN量も、NOD1-3（179 mgN/plant）およびNOD2-4（188 mgN/plant）がWilliams（123 mgN/plant）より高かった。根系の片側に2日間15NO3−を供給すると、最大の15N濃縮（15N%）は直接曝露された分割根で生じ（14–21%）、吸収された15Nの大部分は地上部へ移行した（葉へ約51–58%、茎へ17–20%）。重要な点として、*非標識側*の根および根粒でも15Nが検出され、硝酸塩由来Nが植物体内を移動し、地下部へ再び戻ることが示された。しかし、変異体は非標識側の根粒に存在する総15Nの割合が高い一方（Williams 0.09%に対し変異体0.20–0.47%）、同側の根に存在する割合は低く（Williams 1.58%に対し変異体1.20–1.36%）、その結果、根＋根粒への合計分配は変異体とWilliamsで相対的に類似していると記述された。著者らは、これらのパターンを、地上部から根へのN再循環の変化が過剰根粒形成系統の硝酸塩耐性の主因である可能性は低いことを示す証拠と解釈している。

過剰根粒形成変異系統3系統（NOD1-3、NOD2-4、NOD3-7）と野生型親系統Williamsの種子に、*Bradyrhizobium diazoefficiens* USDA110株を接種し、初期はバーミキュライトで栽培した後、播種13日後に自然条件下のガラス温室で水耕栽培へ移した。植物にはNaNO3を含む規定の培養液（2–3日ごとに更新）を供給した。播種33日後に根を2つのポット（各3 L）に分割した。翌日、一方の側に15N標識硝酸塩（Na15NO3；10 mgN L−1；31.2 atom%15N；計算には30.8 atom%excessを使用）を与え、他方には同じ硝酸塩濃度の非標識溶液を与えた。処理2日後、植物を収穫し、洗浄後に液体N2で凍結し、凍結乾燥してから、葉、茎、基部根および基部根粒、ならびに各ポット側の分割根と分割根粒に解剖した。各画分の乾物重を記録した（反復4）。全Nは改変Kjeldahl分解法で測定し、変換したN2ガスの15N存在比は15N analyzer（N150, JASCO）を用いた発光分光法で定量した。標識硝酸塩由来Nの割合は、試料のatom%excessを標識硝酸塩の濃縮度と比較して算出した。

分割根を用いた15Nトレーサー手法により、本研究は、根の一部で吸収された硝酸塩由来Nが速やかに地上部へ輸送され、その後、反対側（非標識側）の地下部器官にも測定可能な割合で現れることを示し、地上部を介した再分配と整合する結果を得た。過剰根粒形成変異体はWilliamsと比べて、バイオマスおよびN分配のパターン（乾物およびNの根粒への相対的な投資が大きく、根への投資が小さい）が異なり、これは根粒形成の自己調節（autoregulation of nodulation）表現型の変化を反映していた。しかし、中心的な検証課題である「変異体が地上部Nの地下部への再循環を増強し、それが部分的な硝酸塩耐性を説明し得るか」という点については、大きな差は支持されなかった。すなわち、変異体は非標識側で再分配された15Nのうち根粒への配分割合は大きいが、根への配分割合は小さく、根＋根粒の合計割合はWilliamsと概ね同程度と報告された。以上より著者らは、地上部から根へのN再循環は、過剰根粒形成変異体における硝酸塩耐性の主要機構ではない可能性が高いと主張する。さらに、変異体で根粒へのN分配が高いことは、N転流制御の違いというより、根粒量（根粒乾物重）が大きいことによってより簡潔に説明できると示唆される。本論文はまた、これまでの広範な仮説や、自己調節に関する遺伝学的知見（例：根粒形成に対する地上部制御、CLE peptidesやGmNARKのような受容体を介する候補シグナル）にもかかわらず、これら変異体の部分的な硝酸塩耐性の正確な機構は依然として未解明であることを強調している。

著者らは、過剰根粒形成変異体における部分的な硝酸塩耐性の機構は「解明されていない」と明確に結論づけており、本研究のデータは、硝酸塩由来Nの地上部から地下部への再循環の変化が主因ではないことを示すことで、検討すべき範囲を絞り込んだ。今後の研究は、本論文で整理された先行研究で提案されている別の過程に焦点を当てる必要があると示唆される。具体的には、光合成産物供給の変化に関連した根粒成長および窒素固定に対する硝酸塩の迅速な影響、根粒のO2拡散特性を介する可能性のある制御、ならびに師管で輸送される地上部由来N代謝物（例：glutamineやasparagine）によるフィードバック制御である。また本論文は、自己調節シグナル（根から地上部、地上部から根へのシグナル伝達、およびGmNARKなどの遺伝子が関与）を介した根粒開始（nodule initiation）の機構と、すでに分化した根粒の成長・活性を制御する機構とを区別しており、硝酸塩応答を検証する際には、今後これらの要素を実験的に切り分けるべきだと示唆している。

ダイズ(タンパク質が多い種子を作るため窒素を多く必要とする作物で、根粒菌と共生して窒素を得ることもできます。)は、種子にたくさんのタンパク質をためるため、多くの窒素(植物の成長やタンパク質を作るのに欠かせない栄養素で、不足すると生育が悪くなります。)が必要な植物です。ダイズは、根にできる根粒(マメ科植物の根にできるコブ状の器官で、根粒菌が住みつき窒素固定が行われます。)で根粒菌と協力して空気中の窒素を利用できますが、畑では土の中の硝酸塩(植物が土から吸収することが多い窒素の形で、ダイズでは根粒形成や窒素固定を邪魔することがあります。)という形の窒素も吸収します。ところが、硝酸塩は根粒ができることや大きくなること、そして窒素固定のはたらきを強く邪魔することが昔から知られています。この邪魔のしかたには、硝酸塩が当たった場所だけで起こる影響と、植物全体を通じて起こる影響の両方があります。いろいろな理由が考えられてきましたが、決定的な説明はまだありません。
そこで本研究は、根粒がとても多くできる「過剰根粒形成(通常より根粒が極端に多くできる性質で、根粒数の自己調節がうまく働かない場合に起こります。)」の変異体(遺伝子の変化によって性質が変わった個体で、仕組みの解明に役立ちます。)（NOD1-3など）と、ふつうの品種（Williams）で、地上部から地下部へ戻ってくる「硝酸塩由来の窒素の再循環(いったん地上部へ運ばれた窒素が、再び地下部へ戻って使われるような体内での移動のことです。)」に違いがあるかを、15Nで目印をつけた硝酸塩を使う実験で確かめることを目的としました。

植物全体の乾物重(植物体から水分を除いた重さで、成長量やどこに資源を使ったかを比べるのに使います。)は系統間で大きく変わりませんでしたが、過剰根粒形成(通常より根粒が極端に多くできる性質で、根粒数の自己調節がうまく働かない場合に起こります。)の変異体(遺伝子の変化によって性質が変わった個体で、仕組みの解明に役立ちます。)は、根の付け根付近にある根粒(マメ科植物の根にできるコブ状の器官で、根粒菌が住みつき窒素固定が行われます。)の乾物重がWilliamsより大きくなりました。乾物重の割合で見ると、変異体は根粒に回る割合がWilliamsの2倍以上で、その分、根に回る割合はWilliamsより低くなりました。
窒素(植物の成長やタンパク質を作るのに欠かせない栄養素で、不足すると生育が悪くなります。)の濃度や植物全体の窒素量も、変異体の一部（例：NOD1-3、NOD2-4）でWilliamsより高い傾向がありました。
分割根(1つの植物の根を左右など2つに分け、それぞれ別の条件で育てて比較できる実験方法です。)の片側に2日間だけ15Nで目印をつけた硝酸塩(植物が土から吸収することが多い窒素の形で、ダイズでは根粒形成や窒素固定を邪魔することがあります。)を与えると、15Nはまず与えた側の根で強く検出され、多くは葉や茎など地上部へ移動しました。重要なのは、硝酸塩を与えていない反対側の根や根粒からも15Nが見つかったことで、いったん地上部へ行った窒素が地下部へ戻る再分配が起きていると分かりました。
ただし変異体では、反対側の根粒に入る15Nの割合はWilliamsより高い一方で、反対側の根に入る割合は低く、根と根粒を合わせた割合は全体としてWilliamsとだいたい同じでした。著者らは、この結果から「地上部から地下部への窒素の再循環(いったん地上部へ運ばれた窒素が、再び地下部へ戻って使われるような体内での移動のことです。)の違い」が変異体の硝酸塩への強さの主な理由だとは考えにくいと判断しました。

過剰根粒形成(通常より根粒が極端に多くできる性質で、根粒数の自己調節がうまく働かない場合に起こります。)の変異体(遺伝子の変化によって性質が変わった個体で、仕組みの解明に役立ちます。)3系統（NOD1-3、NOD2-4、NOD3-7）とWilliamsを用い、根粒(マメ科植物の根にできるコブ状の器官で、根粒菌が住みつき窒素固定が行われます。)菌を接種して育てました。途中で水耕栽培に移し、根を左右2つに分けて別々の容器で育てる分割根(1つの植物の根を左右など2つに分け、それぞれ別の条件で育てて比較できる実験方法です。)の状態にしました。片側には15Nで目印をつけた硝酸塩(植物が土から吸収することが多い窒素の形で、ダイズでは根粒形成や窒素固定を邪魔することがあります。)、もう片側には普通の硝酸塩を同じ濃度で与え、2日後に植物を収穫しました。
その後、葉・茎・根・根粒などに分けて乾物重(植物体から水分を除いた重さで、成長量やどこに資源を使ったかを比べるのに使います。)を測り、全窒素(植物の成長やタンパク質を作るのに欠かせない栄養素で、不足すると生育が悪くなります。)量と15Nの割合を測定して、どの部位に硝酸塩由来の窒素がどれくらい移動したかを計算しました。

この研究は、根の一部で吸収された硝酸塩(植物が土から吸収することが多い窒素の形で、ダイズでは根粒形成や窒素固定を邪魔することがあります。)由来の窒素(植物の成長やタンパク質を作るのに欠かせない栄養素で、不足すると生育が悪くなります。)がすぐに地上部へ運ばれ、その後、硝酸塩を与えていない側の根や根粒(マメ科植物の根にできるコブ状の器官で、根粒菌が住みつき窒素固定が行われます。)にも戻ってくることを示しました。つまり、地上部を経由した窒素の再分配が実際に起きていると確認できました。
一方で、過剰根粒形成(通常より根粒が極端に多くできる性質で、根粒数の自己調節がうまく働かない場合に起こります。)の変異体(遺伝子の変化によって性質が変わった個体で、仕組みの解明に役立ちます。)は根粒への配分が大きいなど、体の作り方（乾物や窒素の配り方）に特徴はありましたが、地上部から地下部への窒素再循環(いったん地上部へ運ばれた窒素が、再び地下部へ戻って使われるような体内での移動のことです。)が増えたから硝酸塩に強い、という説明は支持されませんでした。変異体で根粒への窒素が多く見えるのは、窒素の移動の仕組みが特別に違うというより、根粒そのものの量が多いことでも説明できる可能性がある、と示されました。

著者らは、過剰根粒形成(通常より根粒が極端に多くできる性質で、根粒数の自己調節がうまく働かない場合に起こります。)の変異体(遺伝子の変化によって性質が変わった個体で、仕組みの解明に役立ちます。)が硝酸塩(植物が土から吸収することが多い窒素の形で、ダイズでは根粒形成や窒素固定を邪魔することがあります。)に部分的に強い本当の理由は、まだ分かっていないと明確に述べています。本研究によって、「硝酸塩由来窒素(植物の成長やタンパク質を作るのに欠かせない栄養素で、不足すると生育が悪くなります。)の再循環(いったん地上部へ運ばれた窒素が、再び地下部へ戻って使われるような体内での移動のことです。)の変化が主因」という可能性は低いと絞り込めました。
今後は、硝酸塩が根粒(マメ科植物の根にできるコブ状の器官で、根粒菌が住みつき窒素固定が行われます。)に与える影響として、光合成で作られる物質の供給の変化、根粒内への酸素の入り方の変化、地上部で作られ師管(葉で作られた糖やアミノ酸などを、植物体内の別の部位へ運ぶ通り道です。)で運ばれる窒素代謝物によるフィードバック(ある結果が次の制御に影響し、働きを弱めたり強めたりする調節のしかたです。)など、別の仕組みを重点的に調べる必要があります。また、根粒が「でき始める段階」の制御と、「できた根粒が成長したり働いたりする段階」の制御は別の可能性があるため、これらを分けて検証することが大切だと示されています。