紡錘糸形成阻害剤処理によるコルチカム科属間雑種の染色体倍加

Gloriosa spp.、Littonia modesta、Sandersonia aurantiaca（Colchicaceae）は、特徴的な花をもつ南アフリカ産の球根性観賞植物として評価されている。園芸形質の多様性を広げ、新しい品種を作出するために、著者らは以前、胚珠培養（ovule culture）を用いてこれら分類群間で複数の属間雑種（intergeneric hybrids）を作出した。しかし、これらの遠縁雑種（wide hybrids）は花粉稔性が極めて低いか、あるいはほとんど認められず（acetocarmine染色で0–2.4%）、そのため後代の交雑育種への利用が制限されていた。紡錘体毒（spindle toxins）を用いた染色体倍加は、遠縁雑種の稔性回復のための確立した戦略であり、同時に倍数化（polyploidization）にしばしば伴う観賞形質（例：コンパクトな生育、太い茎、より大きな花）を得ることにもつながりうる。colchicine（COL）は歴史的に一般的である一方、近年の報告では、amiprophos-methyl（APM）やoryzalin（ORY）が、より効率的で組織損傷が少ない形で倍加を誘導できる可能性が示されている。本研究は、L. modesta × G. superba ‘Lutea’の二倍体雑種（Lit × Gsu-1; 2n=2x=22）を用い、茎頂部位（shoot apical segments）をAPM、COL、ORYで処理することで、Colchicaceaeの属間雑種に対する効率的なin vitro染色体倍加系を開発することを目的とした。

紡錘体毒への曝露後、一部の茎頂セグメントは褐変して枯死した一方、生残したものは通常、セグメント当たり1本のシュートを再生した。処理2か月後、シュート伸長（>1.5 cmと定義）は対照区のセグメントの56.7%で認められた。10 mg L-1 APM、100 mg L-1 COL、500 mg L-1 COLでは、伸長率は対照区と有意差がなく、観察された最高の伸長率は10 mg L-1 APMでの80.0%であった。フローサイトメトリーでは、対照区の17本のシュートはすべて二倍体（2x）であり、二倍体の母シュートにおける倍数性キメラ（ploidy chimera）やpolysomatyの証拠は認められなかった。染色体倍加の結果は、毒素の種類と濃度に依存した。40 mg L-1 ORYから完全な四倍体（4x）シュートが得られ、いくつかの処理（10または20 mg L-1 APM、5または10 mg L-1 ORY）では倍数性キメラ（2x+4x）が生じた。染色体倍加した材料の頻度は、40 mg L-1 APMまたは10 mg L-1 ORYで最も高く（33.3%と報告）、一方でCOL処理では四倍体シュートもキメラシュートも得られなかった。四倍体およびキメラのシュートは、二倍体に比べて節間が短く、よりコンパクトな形態を示した。しかし、発根のためにホルモン無添加のMS培地へ移植すると、四倍体およびキメラのシュートはすべて根を形成しないまま枯死した。ただし、一部のキメラでは塊茎様構造（tuber-like structures）が形成された。

本研究では、胚珠培養により以前得られた二倍体の属間雑種Lit × Gsu-1（L. modesta × G. superba ‘Lutea’; 2n=2x=22）を用いた。塊茎をvermiculite中で20–25℃で栽培し、頂端分裂組織（apical meristems）を含む約5 cmのシュート先端を、次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素1%、5分）で表面殺菌した。外植片（explants）は、植物成長調節物質濃度が異なる3種類のMS基培地（pH 5.8；30 g L-1 sucrose；2 g L-1 gellan gum）に順次移植して培養した。培地は、Medium I（1 mg L-1 NAA、0.2 mg L-1 BA）、Medium II（0.5 mg L-1 NAA、2.5 mg L-1 BA）、Medium III（0.1 mg L-1 NAA、10 mg L-1 BA）であり、Medium III上で2か月ごとに継代培養した。培養は25℃、連続蛍光灯（35 μmol m-2 s-1）下で行った。染色体倍加のため、継代後2か月で約2 cmの茎頂セグメントを採取し、APM（10、20、40 mg L-1）、COL（100、500、1000 mg L-1）、またはORY（5、10、20 mg L-1）を含む液体Medium III中で、25℃・回転振とう（120 rpm）下で24時間インキュベートした。ストック溶液にはDMSOを用い、毒素を含まない液体Medium IIIを対照区とした。洗浄後、セグメントを固体Medium III上に置床し、2か月後にシュート伸長を評価した。再生シュートの倍数性は、葉組織を用いたフローサイトメトリー（Partec PA）により決定し、各シュートについて少なくとも1,500個の核を解析した。

本研究は、茎頂セグメントに対するin vitroでの紡錘体毒処理により、Colchicaceaeの属間雑種で染色体倍加を誘導できることを示した。ただし、その有効性は使用薬剤と濃度に強く依存した。APMとORYは四倍体および／または2x+4xのキメラシュートを生じたのに対し、colchicineは本研究条件では染色体倍加体を生じなかった。著者らは、この傾向が「APMとORYがCOLより染色体倍加で優れることがある」という先行報告と整合すると解釈し、さらにColchicaceae植物が自然にCOLを産生することを踏まえ、この雑種がCOLに対して抵抗性を示す可能性も示唆している。形態的には、四倍体およびキメラシュートは節間が短くコンパクトに生育し、著者らはこの形質が、特に鉢物用途の観賞植物として望ましい可能性があると主張している。一方で、染色体倍加系統の実用化は重大なボトルネックにより制約された。すなわち、四倍体およびキメラシュートが成長調節物質を含まないMS培地で発根できず枯死したことから、報告された再生条件下では、染色体倍加だけでは生存可能な植物体の作出に不十分であることが示された。

著者らは、未解決の主要課題として発根誘導を明確に挙げている。植物成長調節物質を含まないMS培地上では、四倍体および倍数性キメラのシュートが、キメラの一部で塊茎様構造が形成されることがあっても、根を形成しないまま全て枯死したため、今後はColchicaceaeの観賞植物において、染色体倍加シュートが発根し生存できる条件を確立する必要がある。より広い観点では、生存率、シュート再生、倍加効率のバランスをとるために、紡錘体毒の選択と投与量の最適化が必要であり、この雑種ではCOLよりもAPMおよびORYの方が有望であることが示唆された。さらに著者らは、四倍体およびキメラシュートに見られたコンパクトな形態の観賞価値にも言及し、信頼できる発根および順化（acclimatization）プロトコルが確立されれば、染色体倍加材料が育種や鉢物向け品種の作出に有用になりうると示している。

Gloriosa属、Littonia modesta、Sandersonia aurantiacaは、南アフリカ原産で、球根（正確には塊茎）をもつ観賞植物として人気があります。研究者たちは、花の形や大きさなどの「園芸的に良い特徴」を増やして新しい品種を作るために、胚珠培養(受粉後の胚珠を取り出して無菌的に育て、普通の交配では育ちにくい雑種の胚を助けて植物にする技術です。遠い種類同士の交配で役立ちます。)という方法を使って、属が違う植物同士をかけ合わせた雑種（属間雑種(属が異なる植物同士をかけ合わせてできた雑種です。新しい見た目の品種を作れる一方で、子孫を残しにくいことが多いです。)）を作ってきました。
しかし、このような遠い種類同士をかけ合わせた雑種は、花粉がほとんど使えないほど稔性が低く、次の世代の品種改良に使いにくいという問題がありました。そこで本研究では、APM(紡錘体毒の一種で、染色体倍加を比較的効率よく起こし、植物へのダメージが小さい可能性があると報告されています。)、コルヒチン(紡錘体毒の一種で、昔から染色体倍加に使われてきた薬剤です。効く一方で組織へのダメージが大きい場合があります。)、オリザリン(紡錘体毒の一種で、染色体倍加に使われます。コルヒチンより低ダメージで効く場合があるとされています。)という薬剤（紡錘体毒(細胞分裂のときに染色体を引っ張る「紡錘体」の働きを止める薬剤の総称です。うまく使うと染色体の数を増やせます。)）で茎の先端部分を処理して、試験管内で染色体を倍にする方法を作り、雑種の稔性回復や観賞価値の向上につなげることを目的としました。

薬剤処理後、茎の先端の一部は褐色になって枯れましたが、生き残ったものは多くの場合、1つの材料から1本のシュート（新しい芽）が伸びました。処理から2か月後、対照区では約56.7%でシュートが十分に伸びました。10 mg/LのAPM(紡錘体毒の一種で、染色体倍加を比較的効率よく起こし、植物へのダメージが小さい可能性があると報告されています。)処理では伸びた割合が最大で80.0%になり、条件によっては成長への悪影響が小さいことが分かりました。
倍数性を調べると、対照区はすべて二倍体(染色体のセットを2つもつ状態です。多くの植物で基本となる状態です。)のままでした。一方、薬剤の種類と濃度によっては、四倍体(染色体のセットを4つもつ状態です。細胞が大きくなり、茎が太い、花が大きいなどの変化が出ることがあります。)のシュートや、二倍体と四倍体が混ざったキメラのシュートが得られました。四倍体は40 mg/Lのオリザリン(紡錘体毒の一種で、染色体倍加に使われます。コルヒチンより低ダメージで効く場合があるとされています。)で得られ、APMやオリザリンの一部条件ではキメラも出ました。染色体が倍になったシュートが出る割合は、40 mg/LのAPMまたは10 mg/Lのオリザリンで最も高いと報告されました。
ただし、コルヒチン(紡錘体毒の一種で、昔から染色体倍加に使われてきた薬剤です。効く一方で組織へのダメージが大きい場合があります。)処理では、四倍体もキメラも得られませんでした。また、四倍体やキメラは二倍体より節と節の間が短く、コンパクトな見た目になりました。しかし、根を出させるためにホルモンなしのMS培地(植物組織培養でよく使われる標準的な培地です。植物の成長に必要な無機塩類やビタミンなどが入っています。)へ移すと、四倍体とキメラは根を作れず枯れてしまいました。一部のキメラでは塊茎のような構造ができました。

材料には、胚珠培養(受粉後の胚珠を取り出して無菌的に育て、普通の交配では育ちにくい雑種の胚を助けて植物にする技術です。遠い種類同士の交配で役立ちます。)で作られた二倍体(染色体のセットを2つもつ状態です。多くの植物で基本となる状態です。)の属間雑種(属が異なる植物同士をかけ合わせてできた雑種です。新しい見た目の品種を作れる一方で、子孫を残しにくいことが多いです。)（L. modesta × G. superba ‘Lutea’）を使いました。塊茎から伸びたシュート先端を消毒し、MS培地(植物組織培養でよく使われる標準的な培地です。植物の成長に必要な無機塩類やビタミンなどが入っています。)を基本に、植物ホルモンの量が異なる培地へ順番に移しながら培養してシュートを増やしました。
その後、約2 cmの茎の先端部分を切り取り、APM(紡錘体毒の一種で、染色体倍加を比較的効率よく起こし、植物へのダメージが小さい可能性があると報告されています。)・コルヒチン(紡錘体毒の一種で、昔から染色体倍加に使われてきた薬剤です。効く一方で組織へのダメージが大きい場合があります。)・オリザリン(紡錘体毒の一種で、染色体倍加に使われます。コルヒチンより低ダメージで効く場合があるとされています。)を入れた液体培地の中で24時間振とうしながら処理しました。処理後は洗浄して固体培地で育て、2か月後にシュートの伸びを確認しました。染色体が何倍になったかは、葉の細胞核を使ったフローサイトメトリー(細胞核のDNA量を機械で大量に測り、染色体の倍数性（2倍体か4倍体かなど）を推定する方法です。)で調べました。

茎の先端を試験管内で紡錘体毒(細胞分裂のときに染色体を引っ張る「紡錘体」の働きを止める薬剤の総称です。うまく使うと染色体の数を増やせます。)処理することで、Colchicaceae科の属間雑種(属が異なる植物同士をかけ合わせてできた雑種です。新しい見た目の品種を作れる一方で、子孫を残しにくいことが多いです。)でも染色体倍加(染色体のセットを人工的に増やすことです。雑種の不稔を改善したり、花が大きくなるなど形質が変わったりすることがあります。)を起こせることが示されました。ただし、どの薬剤をどの濃度で使うかによって結果が大きく変わりました。APM(紡錘体毒の一種で、染色体倍加を比較的効率よく起こし、植物へのダメージが小さい可能性があると報告されています。)とオリザリン(紡錘体毒の一種で、染色体倍加に使われます。コルヒチンより低ダメージで効く場合があるとされています。)では四倍体(染色体のセットを4つもつ状態です。細胞が大きくなり、茎が太い、花が大きいなどの変化が出ることがあります。)やキメラが得られましたが、今回の条件ではコルヒチン(紡錘体毒の一種で、昔から染色体倍加に使われてきた薬剤です。効く一方で組織へのダメージが大きい場合があります。)では得られませんでした。これは、APMやオリザリンの方が倍加に向く場合があるという過去の報告と合っています。さらに、この科の植物は自然にコルヒチンを作ることがあるため、今回の雑種がコルヒチンに強い可能性も考えられました。
また、四倍体やキメラはコンパクトに育つため、鉢植え向けの観賞植物として価値が出る可能性があります。一方で、倍加したシュートが根を出せず枯れてしまうという大きな問題があり、染色体を倍にするだけでは実際に育てられる植物にするのが難しいことも分かりました。

一番の課題は、四倍体(染色体のセットを4つもつ状態です。細胞が大きくなり、茎が太い、花が大きいなどの変化が出ることがあります。)やキメラのシュートに安定して根を出させる方法を作ることです。生存率、シュートの再生、倍加の効率のバランスを取りながら、薬剤の種類と濃度をさらに調整する必要があります。この雑種では、コルヒチン(紡錘体毒の一種で、昔から染色体倍加に使われてきた薬剤です。効く一方で組織へのダメージが大きい場合があります。)よりAPM(紡錘体毒の一種で、染色体倍加を比較的効率よく起こし、植物へのダメージが小さい可能性があると報告されています。)やオリザリン(紡錘体毒の一種で、染色体倍加に使われます。コルヒチンより低ダメージで効く場合があるとされています。)の方が有望だと考えられます。
今後、発根(シュートから根が出ることです。培養苗を植物として成立させるために重要です。)と環境への慣らし（順化(試験管内の環境で育った植物を、外の環境（湿度や光が変化する条件）に慣らしていく作業です。失敗すると枯れやすいです。)）の方法が確立できれば、染色体倍加(染色体のセットを人工的に増やすことです。雑種の不稔を改善したり、花が大きくなるなど形質が変わったりすることがあります。)した材料は育種や鉢物用品種の開発に役立つ可能性があります。