導管液と茎アポプラスト液の微量相対ウレイド分析によるダイズの窒素固定依存率の推定

ダイズ（Soybean；*Glycine max* (L.) Merr.）はイネ科作物に比べて窒素（N）要求量が高く、そのNは主に3つの供給源、すなわち共生的N2固定（Ndfa）、土壌N吸収（Ndfs）、肥料N（Ndff）に由来する。施肥および栽培管理を改善するには、これらのN供給源がどの程度寄与しているかを割合として定量化することが不可欠である、と著者らは述べる。相対ウレイド法（relative ureide method）は、固定由来Nは主としてウレイド（アラントインとアラントイン酸）として輸送される一方、根由来Nは主に硝酸およびアミドとして輸送される、という生理学的な違いを利用して、固定由来Nの割合（%Ndfa）を実圃場で推定する実用的手法として提示されている。しかし、標準的な相対ウレイド測定（relative ureide assay）では比較的大量の木部液（xylem sap）が必要で作業負担も大きく、また根からの出液（root bleeding）による木部液採取は、乾燥条件下や生育後期（例：R7）ではしばしば困難である。そこで本研究は、(i) 必要な木部液量を大幅に減らし処理能力を高めるマイクロスケールの比色定量法（micro-scale colorimetric assay）を開発・検証すること、(ii) 木部液採取が難しい状況において、圃場携帯型遠心（field-portable centrifugation）で回収した茎のアポプラスト液（stem apoplast fluid）が、相対ウレイド分析用試料として根からの出液木部液の代替になり得るかを評価すること、を目的とした。

マイクロスケール測定法では、ureide-N、amide-N、nitrate-Nの検量線が高い直線性を示し、決定係数はそれぞれ0.994、0.999、0.999であり、従来の大容量法と同等の精度が示された。圃場での採取では、根からの出液木部液量はR1とR5では十分であったがR7で急減し（例として、ある試験では平均がR1で1633 mg、R5で1590 mg、R7で127 mg）、別の年にはR5で木部液を採取できなかった。一方、遠心で得た茎液は全ての生育段階と処理で一貫して採取可能で、R1からR7にかけて増加する傾向があった。しかしこの実用上の利点にもかかわらず、茎液は初期・中期では木部液の組成と一致しなかった。木部液における相対ureide-N割合はR1とR5で約80–90%であったがR7で約60%まで低下したのに対し、茎液ではR1で約50–60%と低く、R7までおおむね一定であった。成分分析では、ureide-N濃度は木部液と茎液で概ね同程度であった一方、茎液はR1およびR5でamide-Nが大幅に高く（場合によってはnitrate-Nも高い）、この組成の変化が相対ureide-N割合の低下を説明し、これらの段階で茎液を用いると%Ndfaを過小評価することを示唆した。R7では、ureide-N、amide-N、nitrate-Nの濃度が木部液と茎液で近くなり、相対ureide-N割合も同程度となったことから、R7では代替可能性が示された。開花期の時刻別採取では、木部液量と絶対濃度は午前10時から午後4時にかけて低下したが、木部液の相対ureide-N割合は88–89%で安定していた。茎液でも相対ureide-N割合は比較的安定（41–46%）であった。さらに、5000 x Gでの遠心は、500–2200 x Gと比べて回収液量と溶質濃度をともに増加させ、著者らはこれを高い遠心力による細胞（液胞）破壊の可能性として解釈した。

著者らは、ureide-N、amide-N、nitrate-Nの既存の比色定量法を小型化し、各測定で試料2.5 μL（従来は50 μL）だけで相対ウレイド分析ができるようにした。反応は1.5 mLのEppendorfチューブ内で行い、反応液の200 μLアリコートを96ウェルマイクロプレートへ移して、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した（ureide-N：520 nm、amide-N：570 nm、nitrate-N：410 nm）。ウレイドは、NaOH加熱、phenylhydrazinium chloride、および強酸性下でのpotassium ferricyanideを用いるYoung and Conway型手順で定量した。アミドはニンヒドリン法（ninhydrin method）で定量し、硝酸はCataldoのsalicylic acid–sulfuric acid法の後にアルカリ化して定量した。検量標準液は、アラントイン（ウレイド標準）、硝酸ナトリウム、アミド標準混合液（グルタミン＋アスパラギン）を各5 mMで調製し、希釈系列で検量線を作成した。標準は重複測定し、検量線の評価に用いた。圃場検証は日本・長岡の畑地で行い、ダイズ品種EnreiにBradyrhizobium japonicum（strain USDA 110）を接種した。2007–2009年の複数の施肥試験では、基肥成分（N、P、K、Ca）の無施用や、R1での尿素追肥（2、5、または10 kg N 10a-1）などを操作した。採取時期はR1、R5、R7とした。根からの出液木部液は、主茎を地際近くで切断し、チューブで約1時間浸出液を回収して得た。茎アポプラスト液は、茎基部の切片をEppendorfチューブに入れ、電池式携帯遠心機で2,200 x G・10秒の遠心により回収した（時刻別採取および遠心力を変えた追加試験も実施）。試料量はチューブの重量測定により重量法で定量した。

本研究は、マイクロスケールの相対ウレイド分析によって、分析精度を高く維持したまま必要試料量を大幅に低減し、処理能力を向上できると結論づけた。反応をマイクロチューブとマイクロプレートに移し、各測定で2.5 μLを用いることで、1日あたりの分析可能数はおよそ20–50サンプルから約200サンプルへ増加し、試薬使用量とそれに伴うコストおよび廃棄物も削減できると著者らは報告している。サンプリング戦略については、遠心で得た茎液はR1およびR5では根からの出液木部液の単純な代替にならないことを明確にした。すなわち、茎液ではamide-N（場合によりnitrate-N）上昇により相対ureide-N割合が低下し、木部液から推定される値より低い%Ndfaを示すことになる。著者らは、この不一致の原因として、遠心により木部溶液とアポプラスト溶液の混合物が回収され、初期段階のアポプラスト区画はアミドに相対的に富む可能性が高いことを挙げている。それでも、木部液の出液が限られる状況、特に生育後期では、茎液の採取は実用的に信頼できる選択肢となる。具体的にはR7で、茎液の化学組成が根からの出液木部液に近づき、相対ureide-N割合も同程度となったため、R7に限っては相対ウレイド法による推定に茎液が使用できる可能性が支持された。また、運用上の制約として、非常に高い遠心力（5000 x G）は試料組成を変化させ得る（細胞を損傷し液胞内容物を放出する可能性）ため、中程度の遠心力（例：2,200 x G）が望ましいとした。

本論文は、結果から導かれる実務的方向性をいくつか示している。第一に、マイクロスケール測定法の枠組みにより、ureide-N、amide-N、nitrate-Nを対象とした高スループットの圃場モニタリングが大幅に可能になり、多数の処理・生育段階・時点にわたるサンプルを必要とする研究で有利であると著者らは位置づけている。第二に、茎液はR1とR5で木部液の代替には不適であるものの、R7で組成が収束することが示されたため、根からの出液木部液が得にくい場合に、R7に限って茎液で相対ウレイド分析を支えるという段階特異的な活用が示唆される。第三に、後期の採取困難に対する方法改善として、R7などの段階で、粗い茎表面から漏れ出る木部液を綿を詰めたチューブで保持し、その後ピペットで回収する代替手法を記述している。最後に、遠心力の影響が観察されたことから、過度なg-forceに伴う人工的な溶質濃縮を避けるため、将来の適用では採取条件を管理・標準化すべきであり、意図する生理学的区画（木部 vs アポプラスト/木部混合液）に合わせてサンプリング手順を整合させる必要性が強調されている。

ダイズは、米や小麦などの作物よりも多くの窒素を必要とします。この窒素は主に、空気中の窒素を根の粒（つぶ）で固定して得る分、土の中から吸収する分、肥料から得る分の3つに分かれます。よい施肥や栽培管理を行うには、これらがそれぞれどれくらいの割合でダイズに入っているのかを数値で知ることが大切です。
その割合を畑で簡単に推定する方法として、相対ウレイド法(ダイズが空気中の窒素をどれくらい固定しているかを、植物の体内を流れる窒素化合物の割合から推定する方法です。根粒で固定された窒素は主にウレイドとして運ばれ、土から吸った窒素は硝酸やアミドとして運ばれやすいという違いを利用します。畑で実用的に使える点が重要です。)があります。ただし通常の測定では、木部液(根から茎へ水や栄養分を運ぶ通り道である木部を流れる液体です。相対ウレイド法では、この液に含まれるウレイド、アミド、硝酸の割合を測ります。)を多く集める必要があり手間がかかります。また、乾燥しているときや生育後期には、根から出る木部液を集めること自体が難しくなります。
そこで本研究は、少ない量の試料で測定できる新しい小型の測定法を作ることと、木部液が集めにくい状況で茎から遠心(試料を高速で回転させ、液体を押し出したり分離したりする操作です。茎の液を短時間で回収できる反面、強すぎる条件では細胞が壊れて成分が変わる可能性があります。)で回収した液が代わりに使えるかを確かめることを目的としました。

新しく作った小型の測定法は、ウレイド(ダイズが根粒で固定した窒素を体内で運ぶときによく使う物質のグループです。代表がアラントインとアラントイン酸で、これが多いほど窒素固定由来の割合が高いと判断しやすくなります。)、アミド、硝酸の測定結果がきれいに直線関係になり、従来法と同じくらい正確に測れました。
畑での採取では、根から出る木部液(根から茎へ水や栄養分を運ぶ通り道である木部を流れる液体です。相対ウレイド法では、この液に含まれるウレイド、アミド、硝酸の割合を測ります。)は生育の初期や中期には十分取れましたが、生育後期（R7）では急に少なくなり、年によっては中期でも取れないことがありました。
一方、茎を遠心(試料を高速で回転させ、液体を押し出したり分離したりする操作です。茎の液を短時間で回収できる反面、強すぎる条件では細胞が壊れて成分が変わる可能性があります。)して得た液は、どの生育段階でも安定して採取でき、後期ほど量が増える傾向がありました。しかし、茎の液は初期や中期では木部液と成分の割合が違い、そのまま相対ウレイド法(ダイズが空気中の窒素をどれくらい固定しているかを、植物の体内を流れる窒素化合物の割合から推定する方法です。根粒で固定された窒素は主にウレイドとして運ばれ、土から吸った窒素は硝酸やアミドとして運ばれやすいという違いを利用します。畑で実用的に使える点が重要です。)に使うと、窒素固定の割合を実際より低く見積もってしまう可能性が示されました。
ただしR7では、茎の液と木部液で成分が近づき、相対ウレイドの割合もほぼ同じになったため、R7に限れば代わりに使える可能性が示されました。
また、遠心の力を強くしすぎると、回収できる液量や成分濃度が不自然に増え、細胞が壊れて余計な成分が混ざる可能性があることも分かりました。

従来は各測定に試料を50 μL使っていましたが、本研究では各測定を2.5 μLでできるように小型化しました。反応は小さなチューブで行い、その後96穴のプレートに移して機械で吸光度(光がどれくらい吸収されたかを表す値です。色が濃いほど吸光度が大きくなり、その値から物質の量を推定します。)を測り、ウレイド(ダイズが根粒で固定した窒素を体内で運ぶときによく使う物質のグループです。代表がアラントインとアラントイン酸で、これが多いほど窒素固定由来の割合が高いと判断しやすくなります。)、アミド、硝酸の量を求めました。
畑の試験では、ダイズに根粒菌(ダイズの根に共生して根粒を作り、空気中の窒素を植物が使える形に変える細菌です。ダイズの窒素固定を支える重要な存在です。)を接種し、肥料条件（成分を入れない区や、開花期に尿素を追肥する区など）を変えて比較しました。試料はR1、R5、R7で採取し、木部液(根から茎へ水や栄養分を運ぶ通り道である木部を流れる液体です。相対ウレイド法では、この液に含まれるウレイド、アミド、硝酸の割合を測ります。)は主茎を切って約1時間しみ出した液を集めました。茎の液は茎の切片を携帯型遠心(試料を高速で回転させ、液体を押し出したり分離したりする操作です。茎の液を短時間で回収できる反面、強すぎる条件では細胞が壊れて成分が変わる可能性があります。)機に入れて短時間回し、底にたまった液を回収しました。

この研究は、相対ウレイド法(ダイズが空気中の窒素をどれくらい固定しているかを、植物の体内を流れる窒素化合物の割合から推定する方法です。根粒で固定された窒素は主にウレイドとして運ばれ、土から吸った窒素は硝酸やアミドとして運ばれやすいという違いを利用します。畑で実用的に使える点が重要です。)を小型化することで、少ない試料量でも高い精度を保ったまま、1日に処理できるサンプル数を大きく増やせることを示しました。試薬も減らせるため、費用や廃棄物の削減にもつながります。
一方で、茎を遠心(試料を高速で回転させ、液体を押し出したり分離したりする操作です。茎の液を短時間で回収できる反面、強すぎる条件では細胞が壊れて成分が変わる可能性があります。)して得る液は便利でいつでも採れますが、R1とR5では成分の割合が木部液(根から茎へ水や栄養分を運ぶ通り道である木部を流れる液体です。相対ウレイド法では、この液に含まれるウレイド、アミド、硝酸の割合を測ります。)と合わず、そのまま使うと窒素固定の割合を低く見積もる危険があります。
しかしR7では茎の液と木部液の成分が近くなり、R7に限っては代替として使える可能性が示されました。また、遠心力を強くしすぎると試料が変質する可能性があるため、中程度の遠心力で行うのがよいとされました。

この小型測定法により、畑で多数のサンプルを効率よく測定できるようになり、さまざまな栽培条件や生育段階での調査が進めやすくなります。
茎の液はR1とR5では代替になりませんが、R7では利用できる可能性があるため、木部液(根から茎へ水や栄養分を運ぶ通り道である木部を流れる液体です。相対ウレイド法では、この液に含まれるウレイド、アミド、硝酸の割合を測ります。)が集めにくい状況での「R7限定の使い方」が提案されます。
また、生育後期には茎表面から漏れる木部液を綿入りチューブで受け止めて回収する方法も紹介されました。今後は、遠心(試料を高速で回転させ、液体を押し出したり分離したりする操作です。茎の液を短時間で回収できる反面、強すぎる条件では細胞が壊れて成分が変わる可能性があります。)条件などを統一して、どの液を測っているのかがぶれないように採取方法を標準化することが重要になります。