サトウキビ（Saccharum officinarum L.）から分離した窒素固定内生菌の窒素固定と窒素放出機構

サトウキビ（Sugarcane：*Saccharum officinarum* L.）は、高いバイオマスをもつC4作物で、多量のスクロースを蓄積できる。エタノール生産での利用拡大により、窒素（N）肥料投入量の削減への関心が高まっている。ブラジルでは、サトウキビが長期間にわたりN施肥なしで栽培されてきたとされる現地観察や、複数の^15Nを用いた研究から、生物学的窒素固定（BNF）が植物体Nに大きく寄与しうることが示唆されてきた。ただし、その規模は品種や無機態Nの利用可能性により変動する。重要な仮説として、サトウキビ組織内に生息する窒素固定性の内部共生菌（diazotrophic endophytes）がN_2を固定し、宿主のN栄養を支える可能性がある。しかし著者らは、（特に *Gluconacetobacter diazotrophicus* など）特定の内部共生菌が植物体内で優勢にN_2固定を行うことの直接的証拠、そして決定的に重要な点として、固定されたNが細菌から植物へ有効に移行することの証拠が、なお限られていると強調する。そこで本研究は、(i) サトウキビ茎由来の窒素固定性内部共生菌分離株のN_2固定活性を、異なるO_2条件下で特徴づけること、(ii) 細菌から周囲培地へのN放出の程度とタイミングを、潜在的なN移行メカニズムの代理指標として評価すること、を目的とした。

サトウキビ搾汁由来の3つの内部共生菌分離株（JA1、JA2、JA15）のうち、JA1が最も明確なN_2固定の表現型を示した。固体LGIP培地では、JA1は0.4% O_2で^15N_2固定とアセチレン還元活性（ARA）が最大となり（固定^15N_2：3.5 nmole h^-1 tube^-1；生成エチレン：3.3 nmole h^-1 tube^-1）、O_2 ≥ 2%では両指標とも低下した。JA2は5%および20% O_2で比較的高いARAを示し、O_2応答が異なることが示唆されたが、提示された結果では、微好気条件下で最も強い固定能を示す株としてJA1が強調された。JA15は、*Herbaspirillum rubribalbicans* と推定されていたにもかかわらず、0–20% O_2の範囲で^15N固定およびARAのいずれも検出されなかった。液体培養では、JA1の^15N_2固定とARAはいずれも0% O_2で最大（それぞれ1.7および1.9 nmole h^-1 tube^-1）となり、O_2増加に伴って低下した。なお、この最適条件は固体培養での最適（0.4% O_2）とは異なっていた。N放出については、標識後24 hの時点で培地中に現れた新規固定^15Nはごく一部にとどまり（0% O_2で約4%：培地0.065に対し、細胞1.7 nmole固定^15N_2 h^-1 tube^-1）、しかし標識後の培養時間を延長すると、培地側の^15Nが増加した。培地中に見いだされる固定^15Nの割合は、20% O_2では16日目までに最大40%に達し、固定が停止した後の遅れての放出と整合的であった。

本研究では、6か月齢サトウキビ（cv. NiF-8）の搾汁から以前に分離され、推定同定された3株の窒素固定性内部共生菌（JA1、JA2：*Gluconacetobacter diazotrophicus*；JA15：*Herbaspirillum rubribalbicans*）を用いた。菌株は1/5濃度のpotato dextrose agar上で維持した。窒素固定アッセイは、無窒素LGIP培地（無機塩、微量元素、bromothymol blue、サトウキビ糖100 g L^-1、サトウキビ茎搾汁5 mL L^-1を含み、pH 6.8に調整）で行った。固体培養アッセイでは、菌をLGIP寒天スラント上で密封した9 mLチューブ内にて30 ℃で6日間培養した。ヘッドスペースガスは真空システムで置換し、^15N_2（99.4 atom% ^15N）30%とAr、O_2（0–20%：0、0.2、0.4、2、5、10、20%）からなる混合気体で100 kPaに設定した。30 ℃で24 h曝露した後、チューブを再度排気し、同一O_2条件でアセチレン10%を添加してARAを測定した。1 h後、ヘッドスペース0.5 mL中のエチレンをガスクロマトグラフィーで定量した。バイオマスは回収・乾燥後に消化（Kjeldahl）し、全Nを測定（indophenol法）した。^15N濃縮は、アンモニア拡散（Conway）後に発光分光法で決定した。増殖動態の評価として、JA1を液体LGIP 300 mLで30 ℃培養し、OD_560およびARAを10日間、毎日測定した。N放出実験では、JA1液体培養をさまざまなO_2条件下で^15N_2に曝露し、遠心分離（12,000 g、10 min）により細胞ペレットと上清に分け、ペレットは反復洗浄した。両画分を消化し、Nおよび^15Nを分析した。さらに、24 hの標識期間後に、細胞と培地の間での^15N分配がどのように変化するかを、追加の時系列測定で定量した。

結果は、サトウキビ茎に関連する内部共生菌分離株の間で、検出可能なN_2固定能とO_2感受性が大きく異なりうることを示した。JA1（およびある程度JA2）は低O_2下で測定可能な^15N_2固定とARAを示した一方、JA15は本研究条件では活性を示さなかった。JA1では、液体培養におけるnitrogenase活性が増殖初期に集中し、6日目以降に急減して7日目以降は非常に低くなったことから、N_2固定を持続させるには細菌の継続的な増殖が必要であることが示唆された。N移行に関して、著者らは、最初の24 hでは新規固定Nの培地への即時放出がほとんどないことを見いだし、これらの培養条件下では、生細胞による固定Nの能動的排出が限定的であることを示唆した。一方で、日数の経過とともに培地中の^15Nが大きく増加し、特に高O_2では顕著であった（20% O_2で16日目に最大40%）。これは、固定が停止した後に遅れて放出が起きるという解釈を支持する。高O_2では酸化ストレスが一因となる可能性が提案され、細胞死や分解を通じて放出が起こる可能性が示された。これらのパターンを、アンモニアが速やかに宿主細胞質へ輸送されるマメ科—根粒菌共生と比較することで、本研究は、サトウキビに関連する内部共生菌が固定Nを提供する経路は、より根本的に異なり、遅い経路である可能性を強調した。以上は、内部共生の窒素固定菌からサトウキビへ固定Nがどのように利用可能になるのかという未解決問題に対し、実験的証拠を付け加えるものである。

本論文は、植物体内での移行の決定的証拠を提示するというより、未解決の機構を示し研究の方向性を指摘している。JA1の固定活性は増殖初期にのみ強く、培養が低増殖段階に入ると低下したため、著者らは今後、サトウキビ器官内の内部共生菌が、nitrogenase活性を維持できるほど十分に連続的な増殖を保てるかどうかを明らかにすべきだと示唆している。培地Nの遅延した濃縮は、N供給が主として細菌の不活化・死・分解後に起こりうることを示しており、植物体内（in planta）でのN移行が、生菌からの放出に支配されるのか、あるいは細菌バイオマスのターンオーバーに支配されるのかを明確にすることが、次の重要課題である。強いO_2依存性と、高O_2で見かけの放出が増えるという所見は、酸化ストレスが内部共生菌の生残とN放出動態に及ぼす影響をさらに調べる必要性も示している。さらに広く、序論で触れられた、特定の内部共生菌が植物組織内で優勢であり活動しているかどうかという不確実性を踏まえると、本研究の所見は、サトウキビ器官内で活発なN_2固定が行われる部位の局在化を進めること、ならびに培養で測定された細菌の固定・放出特性を、現実的な生理条件下での宿主組織への実際のN移動と結び付ける取り組みを継続することを支持している。

サトウキビは、光合成の効率が高く、体が大きく育ってたくさんの有機物を作れる作物です。また、茎に砂糖のもとになるスクロース(いわゆる砂糖の主成分で、ショ糖とも呼ばれます。サトウキビの茎に多くたまるため、砂糖生産やエタノール生産の原料として重要です。)を多くためられます。サトウキビからエタノールを作る利用が広がる中で、栽培に使う窒素肥料(植物の成長に必要な窒素を補うために与える肥料です。収量を増やせますが、コストや環境負荷が問題になるため削減が課題になります。)を減らしたいという関心が高まっています。
ブラジルでは、窒素肥料をあまり与えなくてもサトウキビが育ってきたという報告があり、その理由として、植物と関係する細菌が空気中の窒素を使える形に変える生物学的窒素固定(細菌などが空気中の窒素を、植物が利用できる形（主にアンモニアなど）に変えるはたらきです。窒素肥料を減らせる可能性があるため重要です。)が大きく関わっている可能性が考えられてきました。ただし、その効果は品種や、土の中で使える無機の窒素がどれくらいあるかで変わります。
重要な考え方として、サトウキビの組織の中に住む窒素固定できる細菌が、空気中の窒素を固定してサトウキビの栄養を助けているかもしれない、という仮説があります。しかし、特定の細菌が植物の中で本当に強く窒素固定をしていることや、固定した窒素が細菌から植物へきちんと渡っていることを示す直接的な証拠はまだ少ない、と研究者たちは述べています。
そこで本研究は、サトウキビの茎から分け取った細菌について、酸素の量を変えたときの窒素固定の強さを調べること、そして固定した窒素がどのくらい・いつ培地(微生物を育てるための栄養を含む液体や固体の環境のことです。細菌が固定した窒素が外へ出たかどうかを調べる受け皿として使われます。)へ出てくるかを調べることを目的としました。

サトウキビ搾汁から得た3つの細菌株(同じ種類の細菌でも、分離された由来や性質が少し違う個体群のことです。株ごとに窒素固定の強さや酸素への反応が違うため、区別して調べます。)（JA1、JA2、JA15）のうち、JA1が最もはっきりと窒素固定を行いました。
固体培地(微生物を育てるための栄養を含む液体や固体の環境のことです。細菌が固定した窒素が外へ出たかどうかを調べる受け皿として使われます。)では、JA1は酸素0.4%の条件で窒素固定の指標が最大になり、酸素が2%以上になるとどちらの指標も弱まりました。JA2は別の酸素条件で比較的高い反応を示し、酸素への反応のしかたがJA1と違う可能性が示されました。一方JA15は、どの酸素条件でも窒素固定の反応が確認できませんでした。
液体培養では、JA1の窒素固定の強さは酸素0%で最大となり、酸素が増えるほど低下しました（固体培地での最適条件0.4%とは少し違いました）。
また、固定された窒素が培地へ出てくる量は、最初の24時間ではとても少なく、ほとんどが細菌の中に残っていました。しかし培養を続けて日数がたつと、培地側の窒素（^15N(窒素の安定同位体の一つで、普通の窒素より少し重い窒素です。追跡用の目印として使え、どこで窒素固定が起きてどこへ移動したかを調べるのに役立ちます。)）が増えていきました。特に酸素20%では、16日目までに培地側が最大40%に達し、窒素固定が弱まった後に遅れて放出が起きていることと合っていました。

6か月齢のサトウキビ（品種NiF-8）の搾汁から以前に分離されていた3株の細菌（JA1、JA2、JA15）を使いました。JA1とJA2は *Gluconacetobacter diazotrophicus(サトウキビの体内から見つかることが多い、窒素固定できる内部共生菌として知られる細菌です。ただし植物体内で本当に主役かどうかは議論があり、検証が重要です。)*、JA15は *Herbaspirillum rubribalbicans(植物に関係する細菌の一種で、窒素固定と関連づけられることもありますが、本研究条件ではJA15として窒素固定が確認できませんでした。)* と推定されていました。
窒素を含まないLGIP培地(微生物を育てるための栄養を含む液体や固体の環境のことです。細菌が固定した窒素が外へ出たかどうかを調べる受け皿として使われます。)で細菌を育て、空気中の窒素の代わりに^15N(窒素の安定同位体の一つで、普通の窒素より少し重い窒素です。追跡用の目印として使え、どこで窒素固定が起きてどこへ移動したかを調べるのに役立ちます。)_2ガスを入れて、どれだけ窒素固定が起きたかを測りました。酸素濃度は0〜20%まで段階的に変えました。
窒素固定の評価には、^15Nが細菌に取り込まれる量の測定に加えて、アセチレン還元活性(窒素固定の力を間接的に測る方法です。窒素固定に関わる酵素がアセチレンを別の物質に変える反応を利用し、窒素固定の目安として使います。)（ARA）も使いました。さらに、細菌の増殖の変化とARAの変化を日ごとに追い、固定された窒素が細菌の外（培地）へどの程度移るかを、細菌と培地を分けて測定しました。

サトウキビの茎に関係する内部共生菌(植物の体の中（組織内）に住み、病気の症状を出さずに共に存在する細菌のことです。植物の栄養や成長に関わる可能性があり注目されています。)でも、窒素固定できる強さや酸素への弱さは株によって大きく違うことが示されました。JA1（そして一部JA2）は低い酸素条件で窒素固定が確認できましたが、JA15は本研究の条件では確認できませんでした。
JA1では、窒素固定に関わる反応が細菌の増殖の初期に強く、増殖が落ち着くと急に弱くなりました。このことから、もし植物の中でも同じなら、窒素固定を続けるには細菌が増え続ける状況が必要かもしれません。
さらに重要なのは、固定した窒素が植物へ渡る仕組みに関して、最初の24時間では培地(微生物を育てるための栄養を含む液体や固体の環境のことです。細菌が固定した窒素が外へ出たかどうかを調べる受け皿として使われます。)への放出がほとんどなく、細菌が生きたまま積極的に窒素を外へ出している可能性は高くないと示された点です。一方で日数がたつと培地側の^15N(窒素の安定同位体の一つで、普通の窒素より少し重い窒素です。追跡用の目印として使え、どこで窒素固定が起きてどこへ移動したかを調べるのに役立ちます。)が増え、とくに酸素が高い条件で目立ちました。これは、細菌の活動が止まった後、細菌の弱りや死、分解などを通じて遅れて窒素が出てくる可能性を示します。
この結果は、マメ科植物と根粒菌のように「固定した窒素がすぐ植物に渡る」タイプとは違い、サトウキビの内部共生菌では「もっと遅い経路」で窒素が利用可能になるかもしれない、という見方を強めました。

本研究は、植物体内で本当に窒素が細菌から植物へ移る決定的証拠を示したというより、仕組みがまだよく分かっていない点と、研究の進むべき方向を示したものです。
今後は、サトウキビの体の中で内部共生菌(植物の体の中（組織内）に住み、病気の症状を出さずに共に存在する細菌のことです。植物の栄養や成長に関わる可能性があり注目されています。)が十分に増え続けられるのか、そして増殖が続くことで窒素固定も維持されるのかを確かめる必要があります。
また、窒素が植物へ渡る主な経路が、生きた細菌からの放出なのか、それとも細菌が死んで分解されることで放出されるのかを、植物体内の条件で見分けることが重要になります。加えて、酸素が多いと放出が増えて見える理由として酸化ストレス(酸素が多いなどの条件で、細胞が傷つきやすくなる状態のことです。細菌が弱ったり死んだりすると、結果として窒素が外へ出る可能性があるため重要です。)が関わる可能性もあるため、酸素が細菌の生き残りや窒素放出に与える影響もさらに調べる必要があります。
さらに、どの細菌が植物のどの部位で実際に活発に働いているのかをはっきりさせ、培養実験で分かった性質と、植物の中での本当の窒素移動を結びつけていくことが求められます。