Lactobacillus paracasei K71投与によるオボアルブミン感作したBALB/cマウスにおけるTh1細胞増加とTh2細胞減少

Lactobacilli（乳酸菌）は発酵食品で長年にわたり安全に利用されてきた実績があり、probiotics（プロバイオティクス）としても広く活用されている。これは一部の菌株が宿主の免疫を調節できるためである。提案されている主要な作用機序の一つは、抗原提示細胞からのinterleukin-12（IL-12）誘導であり、これがinterferon-γ（IFN-γ）応答を促進し、type 1 helper T（Th1）とTh2のバランスをTh1優位へと傾ける。この変化は、Th2優位の免疫、IL-4上昇、immunoglobulin E（IgE）産生増加と関連することが多いアレルギー疾患にとって重要だと考えられている。著者らは以前、Sakekasu（sake lees）から強力なIL-12誘導能をもつLactobacillus paracasei K71を分離し、この菌株の経口投与がマウスの血清IgEを抑制することを報告した。これを踏まえ本研究では、加熱殺菌したL. paracasei K71の経口投与がin vivoでTh1/Th2細胞頻度を変化させるかを直接検討することを目的とし、ovalbumin（OVA）で免疫したBALB/cマウスのsplenocytes（脾細胞）に着目するとともに、血清IgEおよびex vivoでのIgE産生も測定した。

OVAで免疫したBALB/cマウスにおいて、加熱殺菌L. paracasei K71（1 mg/day）の経口投与は、水投与対照群と比べて血清中のtotal IgEおよびOVA-specific IgEの両方を有意に低下させた（P < 0.05）。このin vivoの結果と一致して、処置マウスから回収した脾細胞は、100 μg/mL OVAによる14日間のex vivo刺激後に産生するtotal IgEが有意に少なかった（P < 0.05）。一方、OVA非添加の培養ではIgEは検出限界未満であった。ヘルパーT細胞の分極化に関連するchemokine receptorを用いたフローサイトメトリー解析では、K71投与後に、CXCR3を発現するヘルパーT細胞（CXCR3+CCR4− CD3+CD4+）の割合が増加し、CCR4を発現するヘルパーT細胞（CXCR3−CCR4+ CD3+CD4+）の割合が減少した。著者らはCXCR3+CCR4+の二重陽性細胞について、Th0や分極化の程度が低い細胞が含まれる可能性があり不確実性があると述べているが、全体としては、この受容体パターンの変化をin vivoでのTh1細胞の誘導とTh2細胞の減少として解釈している。CD3+CD4+ヘルパーT細胞全体の割合には、群間で大きな変化は認められなかった。

雌のBALB/cマウスを5週齢から使用し、餌と水を自由摂取できる通常の飼育条件下で維持した。Sakekasu由来でKameda Seika Co., Ltd.により維持されているL. paracasei K71をMRS broth（37 ℃、24 h）で培養し、回収・洗浄後、加熱殺菌（105 ℃、15 min）し、凍結乾燥して蒸留水に再懸濁した。6週齢から、マウス（各群n = 6）に対して、加熱殺菌K71を1 mg/日、50 μLの滅菌水で毎日経口投与し、対照群には50 μLの滅菌水のみを投与した。並行して、day 0およびday 14に、OVA 100 μgとAl(OH)3 gel 1 mgを腹腔内投与して免疫した。day 0から28まで7日ごとに尾静脈から採血し、血清を分離して−80 ℃で保存した。total IgEはLO-ME-2/LO-ME-3抗体を用いたサンドイッチELISAで定量し、OVA-specific IgEはOVAをコートしたプレートを用いる同様のELISA形式で測定した。吸光度は450 nmで読み取った。day 35から42にマウスを犠牲死させ、脾細胞を回収して、(i) 2×10^6 cells/mLで100 μg/mL OVAとともに14日間ex vivo培養し、上清中のtotal IgEをELISAで測定、(ii) anti-CD3、anti-CD4、anti-CXCR3（CD183）、anti-CCR4（CD194）で染色してフローサイトメトリーを実施し、リンパ球ゲートで≥10,000イベントを取得した。群間差はFisher’s PLSDを用いたone-way ANOVAで解析し、P < 0.05を統計学的有意とした。

本研究は、OVA免疫BALB/cマウスにおいて加熱殺菌L. paracasei K71の経口投与がIgE応答を抑制し、それに伴って脾臓におけるTh1/Th2バランスがTh1優位へと移行することを結論づけている。血清total IgEおよびOVA-specific IgEの低下は、抗原刺激下での脾細胞のex vivo IgE産生低下によって支持されており、全身性の免疫変化がin vivoでのIgE表現型に寄与していることが示唆される。Th1およびTh2分極化にそれぞれ関連する表面マーカーとしてCXCR3（CD183）とCCR4（CD194）を用いることで、著者らは、IgEの測定値にとどまらない細胞レベルの証拠として、K71投与がTh1関連のヘルパーT細胞集団を増加させ、Th2関連集団を減少させることを示した。これらの所見は、IL-12誘導性のLactobacillus菌株がIgE介在性アレルギーに関連するTh2偏倚の免疫応答を軽減しうるとする既報と整合的である。以上より著者らは、L. paracasei K71を、Th1/Th2バランスの改善とIgE低下を通じてTh2依存性アレルギー病態に有用となり得る、probiotic由来の免疫調節因子候補として位置づけている。

著者らは、L. paracasei K71がatopic dermatitis患者の症状を改善したというヒト臨床試験の証拠（Moroi et al., 2010）を挙げ、本研究のマウスでの機序的知見が臨床的に関連する転帰と一致すると述べている。また、ヒトatopic dermatitisのモデルとして適しているとされるNC/Ngaマウスにおいて、L. paracasei K71の免疫調節作用が症状に与える影響を検討する追加研究が自グループで進行中であるとしている。アレルギー以外にも、K71がTh1関連免疫を促進することから、Th1免疫の増強を介して感染症に対して有益となり得る可能性など、より広い免疫学的機能を持つかもしれないと示唆している。これらの展望は、観察されたTh1方向への変化と整合する可能性として提示されている一方、そうした効果の特徴づけにはさらなる実験的検討が必要であることも認めている。

乳酸菌は、発酵食品などで長い間安全に使われてきた細菌で、体に良い働きをすると期待される「プロバイオティクス」としても利用されています。乳酸菌の中には、体の免疫の働きを調整できるものがあり、その仕組みの一つとして、免疫細胞にIL-12(免疫細胞が作る情報伝達物質で、免疫をTh1寄りに動かすきっかけになりやすい物質です。感染防御に関わる反応を後押しすることがあります。)という物質を作らせ、IFN-γ(Th1系の免疫反応で重要な情報伝達物質で、免疫を強めたり、Th1の働きを支えたりします。Th2側の反応と拮抗する働きがあります。)という反応を強めることで、Th1(ヘルパーT細胞のタイプの一つで、主に感染症などに対する防御に関わり、IFN-γなどを作ります。Th2が強すぎる状態を抑える方向に働くことがあります。)とTh2(ヘルパーT細胞のタイプの一つで、IL-4などを作り、IgEを増やす反応に関わります。アレルギーではTh2が強くなりやすいとされます。)という免疫のタイプのバランスをTh1寄りに変える可能性が考えられています。
アレルギーはTh2が強くなりやすく、IL-4(Th2系で重要な情報伝達物質で、B細胞にIgEを作らせやすくし、Th2の分化も促します。アレルギー反応と深く関係します。)が増えてIgE(アレルギー反応に特に関係する抗体の一種です。IgEが増えると、花粉症やアトピー性皮膚炎などの症状と結びつきやすいとされます。)という抗体が増えやすいことと関係が深いので、Th1/Th2バランスを整えることは重要だと考えられます。
研究者たちは以前、酒粕からIL-12を強く増やす力をもつLactobacillus paracasei K71という乳酸菌を見つけ、この菌を口から与えるとマウスの血液中のIgEが減ることを報告していました。そこで本研究では、加熱して殺菌したK71を口から与えたときに、実際に体内でTh1/Th2のバランスが変わるのかを直接確かめることを目的としました。OVAという物質で免疫反応を起こしたマウスを使い、血清IgE、脾臓の細胞が作るIgE、そしてTh1/Th2に関係する細胞の割合を調べました。

OVAで免疫したマウスに、加熱殺菌(高温で処理して細菌を生きられない状態にすることです。この研究では、生きた菌ではなく加熱処理した菌体でも免疫への影響が出るかを調べています。)したK71を毎日1 mgずつ口から与えると、水だけを与えたグループと比べて、血清中のtotal IgE(特定の抗原に限らず、血液中にあるIgE全体の量です。アレルギー体質の強さの目安として使われることがあります。)とOVAに特異的なIgE(アレルギー反応に特に関係する抗体の一種です。IgEが増えると、花粉症やアトピー性皮膚炎などの症状と結びつきやすいとされます。)の両方がはっきり低下しました。
また、処置したマウスの脾臓の細胞を取り出して、OVAで刺激しながら培養すると、培養液中に出てくるIgEの量も少なくなりました。一方、OVAで刺激しない培養ではIgEはほとんど検出されませんでした。
さらに、フローサイトメトリー(細胞を1個ずつ流して、表面の目印などを光で測り、種類や割合を調べる方法です。免疫細胞の集団の変化を調べるのに使われます。)でヘルパーT細胞の特徴を調べると、Th1(ヘルパーT細胞のタイプの一つで、主に感染症などに対する防御に関わり、IFN-γなどを作ります。Th2が強すぎる状態を抑える方向に働くことがあります。)に多いとされるCXCR3(主にTh1系の細胞に多いとされるケモカイン受容体です。Th1に関係する細胞がどれくらいいるかを見る目印になります。)をもつ細胞の割合が増え、Th2(ヘルパーT細胞のタイプの一つで、IL-4などを作り、IgEを増やす反応に関わります。アレルギーではTh2が強くなりやすいとされます。)に多いとされるCCR4(主にTh2系の細胞に多いとされるケモカイン受容体です。Th2に関係する細胞がどれくらいいるかを見る目印になります。)をもつ細胞の割合が減りました。全体として、K71投与によりTh1が増え、Th2が減る方向の変化が起きたと考えられました。なお、ヘルパーT細胞全体の割合そのものは大きく変わりませんでした。

5週齢の雌のBALB/cマウス(免疫研究でよく使われるマウスの系統です。アレルギーに関係する反応を起こしやすい特徴があり、モデルとして利用されます。)を使い、通常の条件で飼育しました。酒粕由来のL. paracasei K71を培養して集め、105℃で15分加熱して殺菌し、凍結乾燥したものを水に混ぜて使いました。
6週齢から、K71を1日1 mgずつ毎日経口投与し、対照群には同量の水だけを与えました。同時に、day 0とday 14にOVAとAl(OH)3を腹腔内に投与して免疫しました。血液は7日ごとに採取し、血清中のtotal IgE(特定の抗原に限らず、血液中にあるIgE全体の量です。アレルギー体質の強さの目安として使われることがあります。)とOVA-specific IgE(OVAにだけ反応するIgEのことです。アレルギー反応がその抗原に対してどれくらい起きているかを見る指標になります。)をELISA(抗体を使って、血液や培養液の中の特定のたんぱく質の量を測る検査法です。今回の研究ではIgEの量の測定に使われました。)で測定しました。
その後、脾臓の細胞を回収して、OVAで刺激しながら培養してIgE(アレルギー反応に特に関係する抗体の一種です。IgEが増えると、花粉症やアトピー性皮膚炎などの症状と結びつきやすいとされます。)産生を測定し、さらにCXCR3(主にTh1系の細胞に多いとされるケモカイン受容体です。Th1に関係する細胞がどれくらいいるかを見る目印になります。)やCCR4(主にTh2系の細胞に多いとされるケモカイン受容体です。Th2に関係する細胞がどれくらいいるかを見る目印になります。)などの目印を使ってフローサイトメトトリーで細胞の割合を解析しました。

この研究は、OVAで免疫したマウスにおいて、加熱殺菌(高温で処理して細菌を生きられない状態にすることです。この研究では、生きた菌ではなく加熱処理した菌体でも免疫への影響が出るかを調べています。)したL. paracasei K71を口から与えるとIgE(アレルギー反応に特に関係する抗体の一種です。IgEが増えると、花粉症やアトピー性皮膚炎などの症状と結びつきやすいとされます。)の反応が抑えられ、それに伴って脾臓でのTh1(ヘルパーT細胞のタイプの一つで、主に感染症などに対する防御に関わり、IFN-γなどを作ります。Th2が強すぎる状態を抑える方向に働くことがあります。)/Th2(ヘルパーT細胞のタイプの一つで、IL-4などを作り、IgEを増やす反応に関わります。アレルギーではTh2が強くなりやすいとされます。)バランスがTh1寄りに動くことを示しました。
血清IgEが下がったことに加えて、脾臓の細胞がOVA刺激で作るIgEも減ったため、体全体の免疫の変化がIgEの低下につながっている可能性が示されました。また、IgEの量だけでなく、Th1・Th2に関連する細胞集団の変化も示した点に意義があります。これらの結果から、K71はTh2が強くなりやすいタイプのアレルギー反応を弱めるのに役立つ可能性があると考えられました。

研究者たちは、K71が人のアトピー性皮膚炎の症状を改善したという臨床試験の報告もあり、今回のマウスで見えた仕組みが人での結果とも合っている可能性があると述べています。今後は、アトピー性皮膚炎のモデルとして使われるNC/Ngaマウス(アトピー性皮膚炎の症状が出やすいマウスとして知られ、人の病気に近いモデルとして研究に使われます。)で、K71が症状にどう影響するかをさらに調べる研究が進められています。
また、K71がTh1(ヘルパーT細胞のタイプの一つで、主に感染症などに対する防御に関わり、IFN-γなどを作ります。Th2が強すぎる状態を抑える方向に働くことがあります。)の働きを高めるなら、アレルギー以外にも感染症への抵抗力に関係する可能性も考えられますが、そのためには追加の研究が必要だとしています。