イネゴルジ体プロテオーム ： N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-Ⅰ様タンパク質の同定と機能解析

ゴルジ体（Golgi apparatus）は、植物の分泌経路における中心的なハブとして機能し、細胞表層の複雑な多糖の生合成、糖タンパク質（glycoproteins）の加工・修飾、そしてタンパク質や多糖の最終目的地への選別を統括している。プロテオミクス（proteomics）は、動物やシロイヌナズナ（Arabidopsis）では（例：LOPITにより）ゴルジ体構成要素のカタログ化に用いられてきたが、イネのゴルジ体プロテオーム（Golgi proteome）は十分に定義されていなかった。著者らの以前の研究では、cis-ゴルジのマーカー（GFP-SYP31）を用いた分画により、膜輸送因子やER（小胞体）タンパク質は回収された一方で、ゴルジ体在住のglycosyltransferaseはほとんど検出されず、イネのゴルジ体タンパク質をより広く捉えるためには追加のアプローチが必要であることが示唆された。こうした背景のもと、本研究は、(i) NDPaseに基づくゴルジ体マーカー戦略で単離したイネのゴルジ体膜に対してshotgunプロテオミクス解析を行うこと、(ii) そのゴルジ体膜に存在するN-acetylglucosaminyltransferase-Ⅰ-like protein（GNTI-LP）を同定し、生化学的に特徴づけることを目的とした。

NDPase関連ゴルジ体膜画分に対するshotgun LC–MS/MS解析により、酵素や輸送関連因子を含むタンパク質群が検出された。同定されたタンパク質には、reversibly glycosylated polypeptide、putative callose synthase、xylosyltransferase、vacuolar sorting receptor、V-ATPase、Ca2+-ATPase、glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase、ならびに複数の膜輸送関連タンパク質が含まれ、重要な点としてGNTI-LPがこのゴルジ体関連画分から検出された。予測されたGNTI-LPポリペプチドは442アミノ酸からなり、計算上の分子量は51.5 kDaであった。また、その推定アミノ酸配列は、以前に報告されたイネN-acetylglucosaminyltransferase-I（CAD30022）と同一であるとされた。コムギ胚芽（wheat-germ）の無細胞系で合成したタンパク質を用いた機能アッセイでは、UDP-GlcNAc存在下で、(Manα1-6)(Manα1-3)(Man)3-(GlcNAc)2-PAから(GlcNAcβ1-2)(Manα1-6)(Manα1-3)(Man)3-(GlcNAc)2-PAが生成し、加熱処理により反応は消失した。この酵素は、ドナーとしてUDPGalNAcやUDP-Glcを利用しなかった。活性はpH 8.0および30℃で最適であり、pH 5–8の範囲でも検出可能であった。Mn2+またはMg2+を必要とし、EDTAにより阻害された。in vitro合成した組換え酵素におけるUDP-GlcNAcのKmは0.58 μMと報告された。N末端欠失の実験から、膜貫通セグメントを含むN末端領域（M1–Q120）は触媒活性に必須ではないことが示された。anti-GNTI-LP抗血清によるイムノブロットでは、イネのゴルジ体膜中に約51 kDaのバンドが検出され、この画分に酵素が蓄積していることを支持するとともに、イネのゴルジ体マーカーとして有用である可能性が示唆された。

ゴルジ体膜は、6日齢のイネ（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）懸濁培養細胞から、ホモジナイズと差速遠心を行った後、5 mM MgCl2存在下で不連続ショ糖密度勾配を用いて調製した。まず50%ショ糖クッションによりミクロソーム画分を得て、次に30/34/38/42%ショ糖のステップ勾配で分離したところ、NDPase関連ゴルジ体膜は30%層付近に沈降し、画分純度を高めるために2回目の勾配精製を行った。ゴルジ体の濃縮は、Triton X-100で刺激したNDPase活性（基質はIDP、リン酸放出量を定量）によりモニターし、著者らは先行研究に基づき、この画分には細胞質および他オルガネラのマーカー由来の混入が少ないと述べている。プロテオミクスでは、膜タンパク質を可溶化し、還元／アルキル化、トリプシン消化の後、自動化された多次元LC–MS/MSで解析した。GNTI-LPの酵素機能の解析には、コムギ胚芽の無細胞翻訳系で（N末端欠失コンストラクトを含めて）タンパク質を合成し、UDP-GlcNAcと、pyridylaminatedアクセプターオリゴ糖である(Manα1-6)(Manα1-3)(Man)3-(GlcNAc)2-PAとを反応させた。反応生成物はRP-およびSF-HPLC、MALDI-TOF MS、ならびにエキソグリコシダーゼ消化で解析した。ドナー特異性、陽イオン依存性、pH/温度プロファイルを決定し、UDP-GlcNAcのKmを推定した。免疫検出のために、組換えGNTI-LPをEscherichia coliで発現させ、Ni-NTAクロマトグラフィーで精製し、ウサギ抗血清の作製に用いたうえで、ゴルジ体膜画分のWestern blottingに適用した。

NDPaseに基づくゴルジ体膜の濃縮とshotgunプロテオミクスを組み合わせることで、本研究は、この画分が広範（「whole Golgi」）な代表性に整合するタンパク質を捉えている証拠を示し、著者らは、cis-ゴルジ成分に限定されるのではなく、medial/trans-ゴルジ在住タンパク質も含む可能性が高いと解釈している。このプロテオミクスの文脈の中で、本研究はGNTI-LPを同定し、Man5GlcNAc2型アクセプターとUDP-GlcNAcからの直接的な生成物形成に加えて、特徴的な生化学的要件（2価陽イオン；EDTA感受性）およびドナー特異性を示すことで、これがN-acetylglucosaminyltransferase-Iであることを裏づけた。さらに、膜貫通ドメインを含むN末端領域を除去しても活性が失われないことから、触媒決定因子は膜アンカー配列ではなく、ルーメン側の触媒ドメインに存在するという見方が補強された。最後に、イネのゴルジ体膜で約51 kDaの免疫反応性バンドが検出されたことと、データベースに基づく推論としてイネGNTIが単一遺伝子によりコードされることを踏まえ、著者らはGNTI-LPがイネ細胞における有用なゴルジ体マーカーになり得ると提案している。総じて、本論文は、イネのゴルジ体酵素アノテーションに関する標的を絞った前進と、イネのゴルジ体プロテオームのより詳細なマッピングに向けた方法論的ステップの双方に寄与している。

ゴルジ体(細胞内の小器官の一つで、タンパク質や糖鎖を加工し、行き先ごとに仕分けして運ぶ中継地点です)は、植物の細胞の中で、タンパク質や糖を「作り変える」「仕分けして送り出す」働きをまとめて行う重要な場所です。たとえば、細胞の表面をつくる複雑な多糖(たくさんの糖がつながった物質で、植物では細胞壁などの材料になります)を合成したり、糖タンパク質(タンパク質に糖鎖が付いたものです。糖鎖によって性質や働きが変わります)を加工したりします。
これまで動物やモデル植物では、プロテオミクス(細胞や組織に存在する多数のタンパク質をまとめて調べ、種類や量を明らかにする研究方法です)という方法でゴルジ体にあるタンパク質を調べてきましたが、イネのゴルジ体にどんなタンパク質がそろっているかは、まだ十分に整理されていませんでした。以前の研究では、cis ゴルジを目印にしてゴルジ体を集めましたが、ゴルジ体にいるはずの糖転移酵素(糖を別の分子に付け足して糖鎖を作る酵素で、糖タンパク質や多糖の合成に重要です)がほとんど見つかりませんでした。そこで本研究では、別の目印であるNDPase(ゴルジ体の指標として使われる酵素の一つで、特定のヌクレオチド二リン酸を分解する活性を持ちます)を使ってイネのゴルジ体膜を集め、(i) そのタンパク質を網羅的に調べること、(ii) 見つかったGNTI-LP(本研究でゴルジ体膜から見つかったタンパク質で、N-acetylglucosaminyltransferase-Iに似た酵素として解析されたものです)という酵素が本当に目的の働きをするのかを詳しく確かめることを目的にしました。

NDPase(ゴルジ体の指標として使われる酵素の一つで、特定のヌクレオチド二リン酸を分解する活性を持ちます)を目印にして集めたゴルジ体(細胞内の小器官の一つで、タンパク質や糖鎖を加工し、行き先ごとに仕分けして運ぶ中継地点です)膜を、shotgun法のLC–MS/MS(液体クロマトグラフィーで成分を分け、質量分析を二段階で行ってタンパク質断片を同定する分析法です)で分析したところ、酵素や物質輸送に関係する多くのタンパク質が見つかりました。具体的には、糖に関わる酵素や輸送受容体、膜輸送関連タンパク質などが含まれていました。重要な点として、GNTI-LP(本研究でゴルジ体膜から見つかったタンパク質で、N-acetylglucosaminyltransferase-Iに似た酵素として解析されたものです)もこの画分から検出されました。
GNTI-LPは442個のアミノ酸からでき、分子量は約51.5 kDaと見積もられました。また、その配列は、過去に報告されているイネのN-acetylglucosaminyltransferase-I(糖鎖合成の途中で、特定の糖を付け加える酵素で、糖タンパク質の糖鎖加工に重要です)と同じだと判断されました。
コムギ胚芽の無細胞系でGNTI-LPを作り、基質とUDP-GlcNAc(糖を付け加える反応で使われる「糖の材料」の分子の一つで、酵素に糖を渡す役割をします)を加えると、狙い通りの糖鎖生成物ができました。一方で、加熱すると反応は止まり、別のドナー(酵素反応で糖を渡す側の分子のことです。UDP-GlcNAcなどが該当します)分子（UDPGalNAcやUDP-Glc）は使えませんでした。酵素活性はpH 8.0、30℃で最も高く、pH 5から8でも働きました。またMn2+かMg2+が必要で、EDTA(金属イオンを強くつかんで反応から取り除く物質で、金属イオンが必要な酵素を止めるのによく使われます)で阻害されました。UDP-GlcNAcに対するKm(酵素が基質をどれくらい結びやすいかを表す指標で、値が小さいほど少ない基質で反応しやすいと考えられます)は0.58 μMでした。さらに、膜に刺さる部分を含むN末端側を削っても酵素活性が失われなかったことから、反応の中心は膜アンカー部分ではなく別の領域にあると考えられました。抗体を使った検出では、イネのゴルジ体膜に約51 kDaのバンドが見え、GNTI-LPがこの画分に多いことが示されました。

6日育てたイネの懸濁培養細胞をすりつぶし、遠心分離を段階的に行って膜成分を集めました。その後、MgCl2を入れた不連続ショ糖密度勾配を使って、ゴルジ体(細胞内の小器官の一つで、タンパク質や糖鎖を加工し、行き先ごとに仕分けして運ぶ中継地点です)膜を分けました。ゴルジ体の濃縮は、Triton X-100で活性が上がるNDPase(ゴルジ体の指標として使われる酵素の一つで、特定のヌクレオチド二リン酸を分解する活性を持ちます)活性を測って確認し、必要に応じて2回目の勾配精製も行いました。
プロテオミクス(細胞や組織に存在する多数のタンパク質をまとめて調べ、種類や量を明らかにする研究方法です)解析では、膜タンパク質を溶かしてトリプシンで切り、LC–MS/MS(液体クロマトグラフィーで成分を分け、質量分析を二段階で行ってタンパク質断片を同定する分析法です)で同定しました。
GNTI-LP(本研究でゴルジ体膜から見つかったタンパク質で、N-acetylglucosaminyltransferase-Iに似た酵素として解析されたものです)の働きの確認では、無細胞翻訳系(生きた細胞を使わずに、試験管内でタンパク質を合成する仕組みです)でタンパク質を作り、UDP-GlcNAc(糖を付け加える反応で使われる「糖の材料」の分子の一つで、酵素に糖を渡す役割をします)と特定の糖鎖基質を反応させ、HPLCや質量分析などで生成物を調べました。さらに、E. coliで組換えタンパク質を作って抗体を用意し、Western blotting(抗体を使って、特定のタンパク質があるかどうかや大きさを調べる実験方法です)でゴルジ体膜中のGNTI-LPを検出しました。

NDPase(ゴルジ体の指標として使われる酵素の一つで、特定のヌクレオチド二リン酸を分解する活性を持ちます)を目印にして集めたゴルジ体(細胞内の小器官の一つで、タンパク質や糖鎖を加工し、行き先ごとに仕分けして運ぶ中継地点です)膜をshotgunプロテオミクス(タンパク質を細かい断片にしてから質量分析で一気に同定し、幅広くタンパク質を探す方法です)で調べることで、イネのゴルジ体タンパク質をより広く捉えられる可能性が示されました。著者らは、この方法で得られる画分はcisだけでなく、medialやtransを含む「より全体に近いゴルジ体」を反映している可能性が高いと考えています。
また、見つかったGNTI-LP(本研究でゴルジ体膜から見つかったタンパク質で、N-acetylglucosaminyltransferase-Iに似た酵素として解析されたものです)が実際にN-acetylglucosaminyltransferase-I(糖鎖合成の途中で、特定の糖を付け加える酵素で、糖タンパク質の糖鎖加工に重要です)として働くことを、反応生成物、必要な金属イオン、EDTA(金属イオンを強くつかんで反応から取り除く物質で、金属イオンが必要な酵素を止めるのによく使われます)での阻害、ドナー(酵素反応で糖を渡す側の分子のことです。UDP-GlcNAcなどが該当します)特異性などから裏づけました。さらに、膜に刺さるN末端部分を除いても活性が残ることから、酵素反応に重要な部分はゴルジ体内腔側の触媒領域にあると考えられます。
最後に、GNTI-LPはイネのゴルジ体膜で約51 kDaのタンパク質として検出でき、イネのゴルジ体マーカー(目的の細胞小器官や構造を見分けるための目印になる分子や酵素のことです)として役立つ可能性が示されました。