Detection of Extended Spectrum β-Lactamase producing Escherichia coli （ESBL E.coli） from chicken meat in Niigata Prefecture, Japan

基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ産生*Escherichia coli*（ESBL *E. coli*）は、β-ラクタム系抗菌薬の多く（cefotaximeやceftazidimeなどのオキシイミノセファロスポリンを含む）にあるβ-ラクタム環を加水分解できる酵素を産生する抗菌薬耐性菌であり、その結果、治療効果を低下させる。本論文は、ESBL *E. coli*がこの10年で世界的に著しく増加していること、また尿路感染症から重篤な血流感染症まで幅広い感染症を引き起こし得ることを強調している。特に高齢者、最近入院した人、抗菌薬に曝露された人で影響が大きい。ESBL遺伝子はしばしば可動性のあるプラスミドに担われているため、菌種内および菌種間で拡散し得る。ESBLのファミリー（TEM、SHV、CTX-M）のうち、CTX-Mが近年ますます重要になっており、食用動物、特に鶏でESBL遺伝子が報告されている。日本ではデータが限られており、また静岡県でブロイラー農場におけるCTX-M型ESBLが既報であることから、本研究は、日本の新潟県の市場で販売されている鶏肉（生の鶏肝）におけるESBL *E. coli*の存在を調査し、根拠を追加することを目的とした。

新鮮な鶏肝27検体から、培養に基づくスクリーニングにより19検体（70.3%）で*E. coli*が同定された。抗菌薬感受性試験では、ampicillin耐性*E. coli*が6検体（31.5%）で認められ、ESBL *E. coli*は1検体（5.2%）で検出された。確認されたESBL分離株はampicillin耐性であり、clavulanic acidの相乗効果により表現型としてESBL基準を満たした。すなわち、clavulanic acid添加cefotaximeの阻止円径が、clavulanic acid非添加cefotaximeより14 mm超大きかった（本研究でのESBL閾値は>5 mmと定義）。分離株は、生化学的試験のパネルにより*E. coli*であることが再確認され、ESBL分離株は*E. coli*と整合する「典型的」な生化学パターンを示した。CTX-Mグループを標的としたPCRによる遺伝子型判定では、ESBL分離株はCTX-M1およびCTX-M9に陰性である一方、CTX-M2グループでは約800 bpの増幅産物（期待サイズ779–780 bp）が得られ、著者らはESBL遺伝子型をCTX-M2と分類した。考察では、検出率が低かったことは新潟におけるESBLの有病割合が低い可能性を示す一方で、方法上の選択により回収率が低下した可能性もある、と解釈している。

2013年10月15日から11月20日にかけて、日本の新潟県のスーパーマーケットで購入した生の鶏肝27検体を対象とした。各検体は生理食塩水で1:5に希釈し、ストマッカーで均質化したのち、液体画分を培養に用いた。分離では、均質化液100 μlをDHL（Deoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose）寒天培地に塗抹し、42ºCで好気的に一晩培養した。続いて、ピンク色で非粘液性のコロニーをクロモジェニック培地（Tricolor）に画線して37ºCで一晩培養し、青色コロニーを*E. coli*として扱い、感受性試験のために栄養寒天培地で増殖させた。抗菌薬感受性試験はCLSIの指針に従い、0.5 Mcfarlandの菌液をMueller Hinton寒天培地に塗布し、ディスク拡散法でampicillin（AM, 10 μg）、ceftazidime（CTZ, 30 μg）、ceftazidime/clavulanic acid（CTZ/CVA, 30 μg）、cefotaxime（CTX, 30 μg）、cefotaxime/clavulanic acid（CTX/CVA, 30 μg）を用いた。ESBL産生は表現型として、CTXおよび/またはCTZにclavulanic acidを併用した場合の阻止円径が、clavulanic acid非併用の場合より5 mmを超えて大きいときに定義した。生化学的確認には複数の試験（例：Indole、citrate、urease、糖利用能）を用いた。ESBL陽性分離株は、CTX-M1、CTX-M9、CTX-M2グループ用プライマーを用いたPCRで遺伝子型判定を行い、煮沸によるDNA抽出、所定のサイクル条件、2%アガロースゲル電気泳動によって期待される増幅産物サイズ（CTX-M1: 516 bp；CTX-M2: 779–780 bp；CTX-M9: 393 bp）を確認した。

本研究は、新潟県で販売される鶏肝から、ESBL産生*E. coli*株を27の小売検体中1株分離・確認し、PCRによりそのESBL遺伝子型をCTX-M2と同定することで、新潟県の鶏肝にESBL *E. coli*が存在することを示した。この所見は、食品中のESBL汚染に関する日本国内データが限られている中で、追加の根拠として提示されている。回収されたESBL分離株は1株のみであったが、著者らは、食品のESBL *E. coli*汚染は世界的な懸念であり、日本での発生状況を記録することが重要であると強調している。また、鶏肉中のESBL遺伝子とヒト由来分離株との重なりを示唆する国際的研究に言及しつつ、新潟ではそのような関連性を検討する研究はまだ実施されていないと述べている。本研究データの範囲内では、ESBL検出数が少ないことは当該地域での有病割合が低い可能性と整合すると慎重に解釈する一方で、増菌を行わない直接培養という手法により、稀少または優占しない菌が過小検出され得ることも認めている。

著者らは、根拠を強化し検出を改善するための複数の方向性を提案している。第一に、新潟での有病割合をより適切に推定するため、方法の変更、具体的には増菌培養および抗菌薬を含む選択培地を追加し、ESBL *E. coli*が低頻度で存在する場合の回収率を高めることを提案する。第二に、分子学的特徴付けの拡充として、PCR増幅産物のDNAシーケンスにより、グループレベルの分類を超えて耐性遺伝子型を確認・詳細化できる可能性があるとする。第三に、食品とヒトのESBLリザーバーの関連の可能性を評価するには、肉に加えて臨床検体を調べる必要があると主張する。これは、ESBL *E. coli*が日本の臨床現場で検出されていること、また国際研究でヒト腸管のESBL遺伝子が鶏肉に由来し得ることが示唆されているためである。最後に、検体数を増やし、環境サンプリングも含めることで、食肉由来ESBL *E. coli*と臨床分離株の潜在的な関連に関する、より強い根拠を得る必要があるとしている。

ESBL産生大腸菌(人や動物の腸にいる細菌の一種です。多くは無害ですが、条件によっては感染症を起こします。)は、よく使われる抗菌薬（抗生物質）の一部を効きにくくしてしまう「薬に強い菌」です。この菌は世界中でこの10年ほどで増えていて、軽い尿路感染症(腎臓や膀胱など尿の通り道で起きる感染症です。大腸菌が原因になることが多いです。)から命に関わる血液の感染症まで、いろいろな病気の原因になります。特に高齢の人、最近入院した人、抗菌薬を使ったことがある人は影響を受けやすいとされています。
また、ESBLに関わる遺伝子(生物の性質を決める設計図の情報です。耐性遺伝子をもつと抗菌薬が効きにくくなることがあります。)はプラスミド(細菌がもつ小さなDNAで、別の細菌に移りやすい特徴があります。耐性遺伝子が広がる大きな理由になります。)という移りやすい仕組みに乗って広がるため、別の菌にも広がる可能性があります。ESBLにはいくつかのタイプがありますが、近年はCTX-M(近年特に広がっているESBLのタイプです。鶏肉など食品由来でも見つかることがあり、公衆衛生上重要です。)というタイプが特に重要になっています。鶏などの食用動物からもESBL遺伝子が見つかっており、日本では情報がまだ少ないため、新潟県の市場で売られている鶏肝にESBL産生大腸菌がいるかどうかを調べることがこの研究の目的です。

新潟県のスーパーで買った鶏肝27検体を調べたところ、19検体（70.3%）から大腸菌(人や動物の腸にいる細菌の一種です。多くは無害ですが、条件によっては感染症を起こします。)が見つかりました。抗菌薬が効きにくい大腸菌としては、ampicillinに耐性をもつものが6検体（31.5%）で見つかりました。ESBL産生大腸菌は1検体（5.2%）で検出されました。
見つかったESBL産生大腸菌は、clavulanic acid(βラクタマーゼの働きを邪魔して、抗菌薬を効きやすくする物質です。ESBLかどうかの判定にも使われます。)を加えると抗菌薬の効き方がはっきり強まるという特徴があり、検査の基準を満たしました。遺伝子(生物の性質を決める設計図の情報です。耐性遺伝子をもつと抗菌薬が効きにくくなることがあります。)を調べる検査では、CTX-M(近年特に広がっているESBLのタイプです。鶏肉など食品由来でも見つかることがあり、公衆衛生上重要です。)2グループに当てはまる結果が得られ、ESBLの型はCTX-M2だと判断されました。
ただし、見つかった数が少ないのは、新潟での割合が低い可能性がある一方で、菌を増やす工程を入れていないために検出しにくかった可能性もある、と研究者は述べています。

2013年10月15日から11月20日に、新潟県のスーパーマーケットで生の鶏肝27検体を購入して調べました。検体を生理食塩水で薄めて混ぜ、培地(細菌を増やすための栄養を含む材料です。菌を分離したり性質を調べたりするために使います。)に広げて培養し、大腸菌(人や動物の腸にいる細菌の一種です。多くは無害ですが、条件によっては感染症を起こします。)らしいコロニーを選びました。
その後、ディスク拡散法(薬がしみ込んだ紙（ディスク）を培地に置き、菌が増えない円の大きさで薬の効き方をみる方法です。)という方法で、複数の抗菌薬（ampicillin、ceftazidime、cefotaximeなど）がどれくらい効くかを調べ、clavulanic acid(βラクタマーゼの働きを邪魔して、抗菌薬を効きやすくする物質です。ESBLかどうかの判定にも使われます。)を一緒に使ったときに阻止円が5mmより大きく増えるかどうかでESBLかどうかを判定しました。
ESBL陽性になった菌は、生化学検査で大腸菌であることを確かめたうえで、PCR(特定のDNAを増やして検出しやすくする検査法です。耐性遺伝子があるかどうかの確認に使われます。)でCTX-M(近年特に広がっているESBLのタイプです。鶏肉など食品由来でも見つかることがあり、公衆衛生上重要です。)1、CTX-M9、CTX-M2のどれに当たるかを調べました。

新潟県で販売されている鶏肝から、ESBL産生大腸菌(人や動物の腸にいる細菌の一種です。多くは無害ですが、条件によっては感染症を起こします。)が1株見つかり、そのESBLの型はCTX-M(近年特に広がっているESBLのタイプです。鶏肉など食品由来でも見つかることがあり、公衆衛生上重要です。)2だと分かりました。日本では食品中のESBLに関するデータがまだ多くないため、この結果は国内データを増やす根拠になります。
見つかった数は少ないものの、世界的に食品を通じたESBL汚染は問題になっているため、日本でも状況を記録し続けることが大切だと研究は示しています。また、海外研究では鶏肉由来のESBL遺伝子(生物の性質を決める設計図の情報です。耐性遺伝子をもつと抗菌薬が効きにくくなることがあります。)と人の検体で似たものが見つかる例もあり、新潟でも今後そうした関係を調べる必要があると述べています。

今後は、検出の確実性を上げるために、菌を増やす培養（増菌培養(検体の中に少ない菌でも見つけやすくするため、最初に菌を増やしてから検査する方法です。)）や、抗菌薬入りの選択培地(特定の菌だけが増えやすいように工夫した培地です。抗菌薬を入れて耐性菌を見つけやすくすることもあります。)を使って、少数しかいない菌も見つけやすくすることが提案されています。
また、PCR(特定のDNAを増やして検出しやすくする検査法です。耐性遺伝子があるかどうかの確認に使われます。)で大まかなグループを決めるだけでなく、DNAシーケンス(DNAの並び方を詳しく読み取る方法です。PCRよりも細かい種類の違いまで確かめられます。)で遺伝子(生物の性質を決める設計図の情報です。耐性遺伝子をもつと抗菌薬が効きにくくなることがあります。)の詳しい種類まで確かめると、より正確な情報が得られる可能性があります。さらに、鶏肉だけでなく病院などの人の検体も調べて、食品と人の感染のつながりがあるかを検討すること、検体数や環境からのサンプルも増やすことが必要だとしています。