TARDBP DNAメチル化状態によるTDP-43の自己調節機構関連スプライシングの変化

筋萎縮性側索硬化症（ALS）は運動神経細胞が障害される進行性の神経変性疾患であり、TAR DNAbinding protein-43（TDP-43）の病理が関与しています。TDP-43はALSにおいて核から消失し細胞質に蓄積し、TARDBPmRNAの増加が病態に関連するとされています。しかし、孤発性ALS（SALS）においてTARDBPmRNAの発現増加のメカニズムは不明です。本研究では、DNAのメチル化が選択的スプライシングに与える影響に着目し、これがTARDBPの発現量を規定するかどうかをヒト培養細胞およびヒト剖検脳組織で検証することを目的としています。

本研究では、TARDBP3’UTRに存在する15か所のCpG部位が高度にメチル化されていることを発見しました。特に、イントロン7に存在する6か所のCpG部位の脱メチル化が、TDP-43量の自己調節機構に重要な潜在的イントロン6および7の選択的スプライシング効率を下げ、TARDBPmRNAの発現量を増加させることが示されました。さらに、ヒト剖検脳組織の解析により、これらのCpG部位のDNAメチル化状態が脳領域ごとに異なること、特に運動野皮質では加齢に伴い脱メチル化が進行することを明らかにしました。

本研究では、TARDBP3’UTRのDNAメチル化状態を操作するため、DNA脱メチル化酵素を用いたゲノム編集技術を使用しました。HEK293T細胞にTARDBP3’UTRを標的とした脱メチル化ベクターを導入し、DNAメチル化率を解析しました。また、ヒト剖検脳組織から抽出したDNAについて、バイサルファイトシークエンシングを行い、DNAメチル化状態を評価しました。さらに、選択的スプライシングの効率をRT-PCRやDroplet Digital PCRにより解析しました。

本研究は、TARDBP3'UTRの一部であるイントロン7内のCpG部位のDNAメチル化が、TDP-43の自己調節機構に影響を及ぼし、TARDBPmRNAの発現量に関連することを示しました。特に、これらのCpG部位のメチル化状態が脳領域ごとに異なり、運動野皮質での加齢に伴う脱メチル化が顕著であることが明らかになりました。これにより、ALSの病態におけるDNAメチル化の役割を理解するための新たな知見が得られました。

今後の研究では、SALS患者の脳組織を用いて、TARDBPイントロン7内のCpG部位のDNAメチル化状態を詳細に解析することが重要です。また、DNAメチルトランスフェラーゼの活性や他の選択的スプライシングに関与する因子についても検討する必要があります。これらの研究により、ALSの病態メカニズムの解明と新たな治療法の開発に寄与することが期待されます。また、一細胞レベルでの解析を行うことで、各細胞種に特有のメチル化パターンを明らかにすることも今後の重要な課題です。

筋萎縮性側索硬化症（ALS）(運動神経細胞が徐々に壊れていく進行性の病気。)は、運動神経細胞が壊れていく病気です。この病気ではTDP-43(ALSに関与するタンパク質で、正常では細胞核に存在するが、ALSでは細胞質にたまる。)というタンパク質が関わっていますが、TDP-43が細胞の核から消えてしまい、細胞質にたまります。このメカニズムはまだわかっていません。本研究では、DNAのメチル化という現象がTARDBPという遺伝子の発現量にどう影響するかを調べることを目的としています。

研究により、TARDBP遺伝子の3'UTRという部分にある15か所のCpG部位(DNA中のシトシン（C）とグアニン（G）が隣接する場所で、ここがメチル化されやすい。)が特にメチル化されていることがわかりました。特にイントロン7にある6か所のCpG部位のメチル化がなくなると、TARDBP遺伝子の発現量が増えることがわかりました。また、脳の運動野皮質では年齢とともにメチル化が減少することも発見しました。

この研究では、DNAのメチル化状態を操作するために、特別な酵素を用いました。この酵素をHEK293T細胞という細胞に導入し、メチル化率を解析しました。また、ヒト剖検脳組織からDNAを抽出し、バイサルファイトシークエンシングという技術を使ってDNAメチル化(DNAの特定の部分にメチル基が付加される現象で、遺伝子の発現に影響を与える。)状態を調べました。さらに、選択的スプライシング(遺伝子の一部が異なるパターンでつなぎ合わされる現象で、これにより一つの遺伝子から複数のタンパク質が作られる。)の効率をRT-PCRやDroplet Digital PCRで解析しました。

TARDBP遺伝子の一部であるイントロン7のCpG部位(DNA中のシトシン（C）とグアニン（G）が隣接する場所で、ここがメチル化されやすい。)のメチル化が、TDP-43(ALSに関与するタンパク質で、正常では細胞核に存在するが、ALSでは細胞質にたまる。)の自己調節に影響を与え、TARDBP遺伝子の発現量を増加させることを発見しました。また、これらのCpG部位のメチル化状態が脳の運動野皮質で特に変化しやすいことがわかりました。これにより、ALSの病態におけるDNAメチル化(DNAの特定の部分にメチル基が付加される現象で、遺伝子の発現に影響を与える。)の役割について新たな知見が得られました。

今後の研究では、SALS患者の脳組織を用いて、TARDBPイントロン7のCpG部位(DNA中のシトシン（C）とグアニン（G）が隣接する場所で、ここがメチル化されやすい。)のDNAメチル化(DNAの特定の部分にメチル基が付加される現象で、遺伝子の発現に影響を与える。)状態をさらに詳細に解析することが重要です。また、DNAメチルトランスフェラーゼの活性や他の選択的スプライシング(遺伝子の一部が異なるパターンでつなぎ合わされる現象で、これにより一つの遺伝子から複数のタンパク質が作られる。)に関与する因子も研究する必要があります。これにより、ALSの治療法の開発に貢献できることが期待されます。