統合失調症患者の脳内ゲノムにおけるコピー数変異の評価

Copy number variations（CNVs；1 kbを超える範囲にわたるゲノムの欠失または重複）はヒトゲノムで一般的にみられ、統合失調症のCNVリスク座位は、主として末梢リンパ球DNAを用いたゲノムワイド研究から同定されてきた。しかし、脳を含めて個体内に体細胞性のゲノムモザイク（somatic genomic mosaicism）が生じうることを示す証拠が蓄積しており、発生中の細胞の相当部分が染色体異常を示しうることや、組織特異的なゲノム差が報告されている。脳組織における体細胞性の細胞遺伝学的変化（somatic cytogenomic alterations）は、いくつかの神経変性疾患および神経発達障害との関連が示唆されているため、脳特異的な体細胞性CNVが統合失調症の病因（etiology）または神経病理（neuropathology）に寄与するかどうかは未解明である。この問いに答えるため、著者らは統合失調症患者と対照者の死後脳組織でCNVを直接調べた。対象領域は線条体（尾状核）とし、この領域が生涯にわたり増殖する神経幹細胞を含むこと、ならびに体細胞性ミトコンドリア変異が認められることという先行観察に基づいて選定した。また、技術的ばらつきを減らし検出感度を高めることを目的として、ケース–コントロールのペア設計を用いた。これは、モザイクCNVが存在する可能性のある不均一な脳組織では、コピー数変化のシグナルが整数にならない用量（dosage）シグナルとして現れうるためである。

48例の統合失調症患者と48例の対照者の線条体DNAに対してarray CGHを用い、Bonferroni補正を伴う2段階の選択手順後も統計学的に有意であったCNV候補座位を85か所同定した。これらの座位は、17番染色体と21番染色体を除くほぼ全ての染色体に分布していた。座位サイズは3–2200 kb（プローブ数1–746）であった。平均log2比は−1.46から+0.63（OR = 0.36–1.55として報告）に及び、多くの座位は差が小さく（平均log2比が−0.59〜+0.59、すなわち1.5倍未満）、1.5倍を超える差を示した座位は4か所のみであった。6p22.2から6p21.32にまたがる領域には6つのCNV座位が含まれ、主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex）の遺伝子を含んでおり、統合失調症のGWASシグナルと整合的であった。既報のアジア人白血球CNVデータと比較すると、85座位中59座位は既報領域と重なり、26座位は重ならなかった。効果が相対的に大きい10座位に焦点を当てたqPCR検証では、希少CNV（putative rare CNVs）とみなした6座位中2座位（Hs03385437およびCC70L1J）と、暫定的な共通バリアント（provisional common variants）として選んだ4座位中2座位（Hs03765933およびHs03298358）で、統合失調症に関連するコピー数（dosage）差が確認された。さらに線条体と前頭前野（prefrontal cortex）の両方で追加評価した2座位では、コピー数比（患者/対照）は概して1.0未満だったが、2つの脳領域間に有意差はなかった。

死後の線条体組織（尾状核）を、慢性統合失調症の48名（男性30名、女性18名；平均年齢64.5 ± 12.5歳）と、神経精神疾患の既往がない年齢マッチ対照48名（男性30名、女性18名；平均年齢64.2 ± 12.0歳）から取得した。診断はDSM-IIIまたはDSM-IVの記録を用いて確認し、採取脳は通常の病理染色で神経変性所見を欠いていた。死後経過時間は群間で有意に異なっていたが、著者らはDNA品質に検出可能な差はないと報告している。高分子DNAを抽出し、品質チェック（分光光度法；一部はゲル電気泳動）を行った。ゲノムワイドのスクリーニングには、Agilent SurePrint G3 Human CGH Microarrays（1 M）を二色競合法で使用した。Cy3標識した対照DNAとCy5標識した統合失調症DNAをランダムにペア化して共ハイブリダイズし、参照ゲノムDNAを用いずにケース–コントロールの直接比較を可能にした。CNV検出にはADM-2アルゴリズムと2段階選択戦略を用いた。Selection 1では、gain/lossコールの差が大きい1381座位を同定した（浸透率サマリーに基づき、差が≥4となる閾値で判定）。Selection 2では、プローブレベルのlog2比を平均0に対して両側t検定で評価し、座位内でシグナルと確率を集約し、Bonferroni補正を適用して85座位を得た。標的検証にはTaqMan qPCRを用い、RNasePを内部対照としてCT値からコピー数を推定した（CopyCaller v1.0）。統計評価として、ペア単位の比較にはANOVAまたは両側t検定を、群単位の評価にはカイ二乗検定およびMann–Whitney U検定を用いた。

著者らは、高密度array CGHにペア型ケース–コントロール設計と統計学的フィルタリングを組み合わせることで、観察される用量差の多くが小さい場合でも、死後脳組織において統合失調症と関連しうるCNV候補領域のリストを作成できると結論づけた。同定された85候補座位には、一般的なCNVと重なる領域に加え、アジア人白血球由来CNVデータセットでは報告されていない26領域が含まれていた。著者らは、これらの一部には、統合失調症や他の精神疾患で既に関連が示されている、示唆されている、または発現変化が報告されている遺伝子（ANTXRL, CHST9, DNM3, NDST3, SDK1, STRC, and SKY）が含まれるため、有用な情報となりうると主張している。一方で本論文は方法論上の制約も強調している。不均一な脳組織におけるモザイクCNVは、影響を受けていない細胞由来DNAによって希釈され、小さな効果量となり、従来のqPCRでは検証が困難になりうる。また、同一個体の末梢DNAを検査できなかったため、体細胞性の脳CNVと生殖細胞系列（germline）バリアントを決定的に区別できない。限られた領域比較（線条体 vs 前頭前野）では、検査した座位で有意差は見いだされなかったが、著者らは、これは発生初期に生じた体細胞イベントの可能性を否定するものではないと述べている。総じて本研究は、統合失調症における脳限定の体細胞性CNVを決定的に示すものというより、リソース提供と実現可能性の評価として提示されている。

本研究は、統合失調症における体細胞性ゲノムモザイクと細胞遺伝学的不安定性（cytogenomic instability）をより決定的に検証するための出発点と位置づけられている。著者らは、候補座位の多くで患者–対照差が非常に小さい（統計学的有意性が極めて高い座位であってもOR = 0.988–1.055を含む）ため、感度向上が必要だと主張する。これらは混合集団内で異常ゲノムが希釈されている状況と整合しうるが、技術的には確認が難しい。単一細胞qPCRやFISHなどの手法は、原理的には希釈効果を軽減しうるものの、標的細胞集団の同定が必要であること、多数の個別細胞を解析する労力、FISHに適した処理済み脳組織が必要であることなど、実務上の障壁があることも認めている。さらに、同定されたCNVがgermlineではなく体細胞性であることを判断するには、同一被験者の生殖細胞DNA（または末梢組織）を用いた比較解析が必要であると強調しているが、現研究ではそのデータがなかった。加えて、今後の研究では、体細胞性モザイクを評価し、本研究で同定された候補CNV領域内にある統合失調症関連の細胞遺伝学的変化を検証するために、より精緻な手法を開発すべきだとしている。

CNVという「DNAの一部が減ったり増えたりする変化」は、人のゲノム(DNAに書かれた遺伝情報の全体のことです。CNVはゲノムの構造の違いとして扱われます。)（遺伝情報全体）の中でよく見つかります。統合失調症では、これまで主に血液（リンパ球）から取り出したDNAを使った大規模研究で、病気に関わるCNVの場所が調べられてきました。
しかし最近、同じ人の体の中でも、細胞によってDNAの状態が少し違うこと（モザイク状の違い）が起こりうる、という考えを支持する研究が増えています。特に脳では、発生の途中で一部の細胞に染色体の異常が起きる可能性や、組織ごとにDNAが少し違う可能性が報告されています。
そこでこの研究では、「脳の中だけで起きる体細胞性のCNVが、統合失調症の原因や脳の変化に関わるのか」を確かめるために、統合失調症の人とそうでない人の死後脳組織を使って、CNVを直接調べました。調べた場所は線条体(脳の深い場所にある領域で、運動や学習などに関わります。この研究ではDNAを取り出して解析した場所です。)（尾状核(線条体の一部の構造です。研究では、線条体の中でもここを対象にしています。)）で、ここは一生の間増え続ける神経幹細胞(神経細胞などに分化でき、増える能力も持つ細胞です。線条体には生涯にわたり増える神経幹細胞がいることがあり、モザイク変化が起きる可能性の理由として挙げられました。)が含まれることなどから、変化が見つかりやすい可能性があると考えられたためです。
また、脳組織は細胞の種類が混ざっていて不均一なので、CNVが一部の細胞にしかない場合、変化が「はっきりした整数の差」ではなく「薄まったような小さな差」として見えることがあります。そのため、技術的なばらつきを減らし見つけやすくする目的で、患者と対照を1対1で比べるペア設計を使いました。

統合失調症48例と対照48例の線条体(脳の深い場所にある領域で、運動や学習などに関わります。この研究ではDNAを取り出して解析した場所です。)DNAを、array CGH(多数のDNAプローブを並べたアレイで、患者と対照のDNA量の比を広い範囲で測り、欠失や重複を推定する方法です。この研究の主要な探索手段です。)という方法で調べました。その後、2段階の絞り込みと厳しい統計補正を行っても有意だったCNV候補の場所を85か所見つけました。これらは17番と21番染色体以外のほぼ全ての染色体に広がっていました。
CNVの大きさは約3〜2200kbで、多くの場所では患者と対照の差が小さく、1.5倍を超えるような大きな差があったのは4か所だけでした。
また、6番染色体の6p22.2〜6p21.32の領域には6つのCNV候補があり、免疫に関係する遺伝子群（MHC）を含んでいて、統合失調症のGWAS(多数の人のゲノム全体を調べて、病気と関連する遺伝子領域を探す研究方法です。過去の統合失調症研究でMHC領域が注目されてきました。)でよく注目される領域とも一致していました。
さらに、既に報告されているアジア人の血液由来CNVデータと比べると、85か所のうち59か所は重なりましたが、26か所は重なりませんでした。
差が比較的大きい10か所についてqPCR(DNAの量を増幅しながら測って、相対的な量の違いを調べる方法です。この研究では、アレイで見つけた候補の一部を確かめるために使いました。)で確かめたところ、希少CNVとして扱った6か所のうち2か所、共通の変化かもしれないとして選んだ4か所のうち2か所で、統合失調症と関係するコピー数の差が確認されました。さらに2つの候補について、線条体と前頭前野(思考、判断、計画などに関わる脳領域です。線条体と比較して、コピー数の違いが脳領域特異的かどうかを確かめるために使われました。)の両方で比べましたが、脳領域間の有意な差は見つかりませんでした。

対象は、慢性統合失調症の死後脳48名分と、年齢をそろえた対照48名分で、どちらも男女比も同じでした。診断はDSM-IIIまたはDSM-IVの記録で確認し、脳の通常の病理検査では強い神経変性の所見がないものが使われました。
線条体(脳の深い場所にある領域で、運動や学習などに関わります。この研究ではDNAを取り出して解析した場所です。)（尾状核(線条体の一部の構造です。研究では、線条体の中でもここを対象にしています。)）からDNAを取り出し、品質をチェックした上で、Agilentの高密度CGHマイクロアレイ（約100万プローブ）で患者と対照を二色で直接比較しました。参照ゲノム(DNAに書かれた遺伝情報の全体のことです。CNVはゲノムの構造の違いとして扱われます。)DNAは使わず、患者と対照をランダムにペアにして同じアレイ上で比べることで、測定上のぶれを減らす工夫をしました。
CNV検出はADM-2という方法で行い、まず差が大きい候補を広く拾い、その後プローブごとの信号を統計的に検定し、座位ごとにまとめ、Bonferroni補正(たくさんの場所を同時に検定すると偶然の「有意」が増えるため、それを厳しく抑える統計的な調整法です。85か所に絞り込む際に使われました。)で最終的に85か所に絞りました。
検証にはTaqMan qPCR(蛍光プローブを使ってqPCRをより特異的に測る方式です。候補座位のコピー数推定に用いられました。)を使い、RNaseP(qPCRでDNA量の基準として使われることが多い遺伝子です。測定のぶれを減らすための内部対照として使われました。)を基準としてコピー数を推定し、統計的な比較も行いました。

この研究は、高密度array CGH(多数のDNAプローブを並べたアレイで、患者と対照のDNA量の比を広い範囲で測り、欠失や重複を推定する方法です。この研究の主要な探索手段です。)と患者・対照のペア比較、さらに統計的な絞り込みを組み合わせれば、脳組織で見えるコピー数の差が小さい場合でも、統合失調症に関係する可能性のあるCNV候補領域をリストとして作れることを示しました。
見つかった85か所の中には、一般的に知られるCNVと重なる場所だけでなく、アジア人の血液由来データでは報告されていない26領域も含まれていました。これらの一部には、統合失調症などの精神疾患との関連が示されたり、脳での発現の変化が報告された遺伝子が含まれるため、今後の研究の手がかりになる可能性があります。
一方で、脳は細胞が混ざった組織なので、もしCNVが一部の細胞にしかない場合、その信号が正常な細胞のDNAに「薄められて」小さく見え、qPCR(DNAの量を増幅しながら測って、相対的な量の違いを調べる方法です。この研究では、アレイで見つけた候補の一部を確かめるために使いました。)などで確かめにくいという限界もあります。また、同じ人の血液などのDNAが手元になかったため、そのCNVが「脳だけで後から起きた変化」なのか、「生まれつき全身にある変化」なのかを決定的に区別できませんでした。
そのため本研究は、「脳限定の体細胞性CNVを決定的に証明した」というより、「候補リストの提供」と「このやり方でどこまでできるかの評価」としての意味が大きいとまとめられています。

多くの候補では患者と対照の差が非常に小さく、より高い感度で検出・検証できる方法が必要だと述べています。もし原因が「一部の細胞だけが異常を持つモザイク」なら、小さな差として見えるのは自然ですが、それを確かめるのは技術的に難しいからです。
単一細胞qPCR(1つの細胞ごとにqPCRを行う方法です。混ざった組織で起きる「薄まり」の問題を減らせるため、モザイクの検証に役立ちます。)やFISH(染色体上の特定のDNA配列を蛍光で染めて、細胞内での位置やコピー数の異常を観察する方法です。探索には不向きですが、狙った領域の確認に使えます。)のように、細胞ごとに調べる方法なら「薄まり」を減らせますが、対象となる細胞集団の特定や、多数の細胞を調べる手間、適切に処理された脳組織が必要など、実務面の壁があります。
また、CNVが本当に体細胞性かどうかを判断するには、同じ被験者の血液や生殖細胞由来DNAと比べる必要があるため、今後はそのような比較ができるデータと、より精密な手法の開発が求められるとしています。